cực phổ xung vi phõn. [14]
Chỳng tụi tiến hành chạy, đo đường cong cực phổ (cực phổ đồ) xung vi phõn trờn thiết bị 757VA Computrace của từng mẫu chứa chất chuẩn metrodinazole, cefadroxile để xỏc định độ lặp của phương phỏp.
Độ lặp lại của phương phỏp được tiến hành phõn tớch ở 3 nồng độ: thấp, trung bỡnh và cao. Ở mỗi mức nồng độ tiến hành với 6 lần đo, khảo sỏt độ lặp lại của chiều cao dũng khuếch tỏn giới hạn xung vi phõn. Đỏnh giỏ độ phõn tỏn của số liệu dựa vào giỏ trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD%)
Độ lệch chuẩn tương đối: 100 X
S %
RSD =
(2.15)
II.4.1.6. Khảo sỏt độ đỳng của phương phỏp
Mục đớch độ đỳng của phương phỏp cực phổ xung vi phõn nhằm đỏnh giỏ sự phự hợp của kết quả thực nghiệm so với giỏ trị được coi là thực cú trong mẫu.
Độ đỳng của phương phỏp được xỏc định bằng phương phỏp thờm chuẩn. Độ đỳng của phương phỏp được đỏnh giỏ dựa trờn việc khảo sỏt khả năng tỡm lại của chất chuẩn thờm vào mẫu tự tạo.
Thờm một lượng chớnh xỏc chất chuẩn metrodinazole hoặc cefadroxile (đó biết trước nồng độ) vào mẫu tự tạo bằng khoảng 20% lượng chất metrodinazole (cefadroxile) cú sẵn trong mẫu tự tạo sao cho tổng nồng độ của chỳng nằm trong khoảng nồng độ đó khảo sỏt độ tuyến tớnh. Độ đỳng của phương phỏp được xỏc định từ tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn được tớnh từ đường chuẩn hoặc thờm chuẩn (thực nghiệm) được so với lượng chất chuẩn metrodinazole (cefadroxil) thờm vào theo tớnh toỏn.
II.4.2. Nghiờn cứu ứng dụng
Ứng dụng quy trỡnh phõn tớch theo phương phỏp cực phổ xung vi phõn để xõy dựng quy trỡnh định lượng hoạt chất C6H9N3O3 (metrodinazole) và C15H14ClN3O4S.H2O (cefadroxile) bằng phương phỏp đường chuẩn và thờm chuẩn trong thuốc khỏng sinh do một số Cụng ty Dược sản xuất.
II.5. Phương phỏp nghiờn cứu
Trong đề tài của khúa luận này chỳng tụi sử dụng phương phỏp thực
nghiệm trờn mỏy đo cực phổ đa năng 757VA Computrace rất hiện đại. Cỏc bước tiến hành:
- Hũa tan mẫu, xử lý mẫu
-Xỏc định hàm lượng hoạt chất C6H9N3O3 (metrodinazole) trong mỗi loại viờn nang khỏng sinh do 3 nhà sản xuất sau:
- Cụng ty dược phẩm Sanofi-Aventis Việt Nam - Cụng ty cổ phần dược phẩm Hà Tõy
- Cụng ty dược phẩm Unique pharmaceutical -Ấn Độ
- Xỏc định hàm lượng hoạt chất (C15H14ClN3O4S.H2O ) (cefadroxile) trong mỗi viờn nang khỏng sinh do 3 nhà sản xuất sau:
- Cụng ty cổ phần dược phẩm Trung Ương - Vidapha - Cụng ty cổ phần xuất nhập khẩu y tế Domesco - Cụng ty dược phẩm Mebiphar
Xử lý thụng kờ kết quả phõn tớch được theo đường chuẩn và thờm chuẩn. Cuối cựng so sỏnh số gam, % hàm lượng hoạt chất C6H9N3O3 (metrodinazole) 250mg và số gam, hàm lượng hoạt chất (C15H14ClN3O4S.H2O ) cefadroxile 500mg chỳng tụi phõn tớch so với ghi trờn nhón cú đỳng khụng?
II.6. Tớnh giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng . [14,22] II.6.1. Giới hạn phỏt hiện (limit of detection- LOD)
Theo IUPAC và ISO, LOD được xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phõn tớch mà phương phỏp phõn tớch cú thể phỏt hiện được Như vậy, LOD phụ thuộc và thành phần nền của mẫu phõn tớch và do đú phải được đỏnh giỏ cho mỗi loại nền mẫu khỏc nhau khi sử dụng phương phỏp phõn tớch và phải được cụng bố trong tài liệu về xỏc nhận giỏ trị sử dụng của phương phỏp.
Như vậy cú thể cú một số cỏch xỏc định LOD của phộp phõn tớch như sau:
- Qui tắc 3σ
LOD được xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phõn tớch mà hệ thống phõn tớch cũn cho tớn hiệu phõn tớch (yL) khỏc cú nghĩa với tớn hiệu của mẫu trắng hay tớn hiệu nền (blank or background). Cần chỳ ý mẫu trắng trong trường hợp này phải là mẫu cú thành phần nền như mẫu thực nhưng khụng chứa chất phõn tớch
Tức là : yLOD= yB +k.SB
Với yB là tớn hiệu trung bỡnh của mẫu trắng sau nb thớ nghiệm (ớt nhất 10 thớ nghiệm độc lập). SB là độ lệch chuẩn khi đo lặp lại tớn hiệu của mẫu trắng, k là đại lượng số học được chọn theo độ tin cậy mong muốn. Với độ tin cậy cần đạt là 99% thỡ k≈3 1 1 nB yB yBj j nB = ∑ = ; 1 2 ( )2 1 S B yBi yB i nB = ∑ − −
Như vậy, nồng độ nhỏ nhất mà thiết bị phõn tớch cú thể phỏt hiện được theo phương trỡnh hồi qui dạng y= a+bx trong phương phỏp đường chuẩn là:
3
yB SB a
xLOD = + b −
Mẫu trắng (Blank) thường được tạo ra khi khụng cú chất phõn tớch. Tuy nhiờn, trong nhiều trường hợp khi khụng cú chất phõn tớch thỡ khụng thể đo được tớn hiệu đo nờn cú thể thay mẫu trắng bằng mẫu thờm chuẩn (spiked)
bằng cỏch thờm một lượng biết trước chất phõn tớch ở nồng độ nhỏ nhất cú thể ghi nhận được tớn hiệu vào nền mẫu thực, sau đú đo tớn hiệu phõn tớch và cũng tớnh độ lệch chuẩn tương tự như trờn.
II.6.2.Giới hạn định lượng ( limit of quantity- LOQ)
LOQ được xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phõn tớch mà hệ thống phõn tớch định lượng được với tớn hiệu phõn tớch (yQ) khỏc cú ý nghĩa định lượng với tớn hiệu của mẫu trắng hay tớn hiệu nền (blank or background).
yQ= yB + K. SB trong đú SB: Độ lệch chuẩn mẫu trắng.
Cú 3 cỏch xỏc định giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng:
II.6.2.1. Cỏch thư nhất: Tiến hành nb thớ nghiệm mẫu trắng (nền), từ kết quả tớnh
YL = K.Sb + Yb
Y = b.x + a
Yb là tớn hiệu trung bỡnh của mẫu trắng sau nb thớ nghiệm (>20)
1 1 nb Yb Ybj nb j = ∑ =
Sb độ lệch chuẩn của tớn hiệu mõu trắng.
Sb= 1 ( )2 1 1 nb Ybj Yb nb j∑ − − =
K - là đại lượng số học chọn theo độ tin cậy mong muốn.
Như vậy: . b L b K S X X b = +
Vỡ mẫu trắng được pha với nồng độ chất phõn tớch Xb = 0, nờn:
XL= K S. b
LOD b
= Sb: Độ lệch chuẩn mẫu trắng.
II.6.2.2.Cỏch thứ hai theo đường chuẩn: Khi khụng phõn tớch mẫu trắng thỡ xem Sb đỳng bằng sai số của phương trỡnh hồi quy (đường chuẩn) YL = K.Sb + Yb hay Yb=b.Xb + a → Xb=0 → Yb = a và Sb = Sy thay Sb = Sy vào phương trỡnh trờn được:
y D K.S = b LO Với K = 3.(quy tắc 3σ ): D 3.Sy = b LO (Đường chuẩn) y K.S = b
LOQ (3.5) Với K = 10.(quy tắc 3σ ): D 10.Sy =
b
LO
- Xõy dựng đường chuẩn y = bx + a . Sau khi xử lý thống kờ theo phương phỏp hồi quy tuyến tớnh sẽ cú được cỏc độ lệch chuẩn và chấp nhận Sb = Sy ; yb = a khi đú: Giới hạn phỏt hiện: 3Sy LOD b = ; Giới hạn định lượng: 10Sy LOQ b = - Nếu đường chuẩn y = a.x + b:
Giới hạn phỏt hiện: 3.Sy D= LO a ; Giới hạn định lượng: y 10.S D= LO a . II.6.2.3.Cỏch thứ ba theo (nồng độ thấp nhất của đường chuẩn đo được)
YL = K.Sb + Yb Y = b.x + a
Mặt khỏc khi đo mẫu trắng a = 0 nờn:
3 3 . . b b b b b b b b Y S S X Y b X b LOD X b Y = → = → = = → 10 .b b b S X LOQ Y =
Xỏc định giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng bằng cỏch đo lặp lại 20 lần đối với dung dịch cú nồng độ nhỏ nhất của đường chuẩn đo được pic. Cỏc điều kiện đo như khi lập đường chuẩn, chấp nhận sự sai khỏc giữa độ lệch chuẩn của dung dịch và độ lệch chuẩn của mẫu trắng là khụng đỏng kể.
II.7. Xử lý kết quả thực nghiệm [8]
Kết quả thực nghiệm thu được khi khảo sỏt cỏc điều kiện tối ưu, xõy dựng đường chuẩn, đường them chuẩn, đỏnh giỏ đường chuẩn, tiến hành tớnh hàm lượng mẫu xử lớ trờn phần mềm Microsoft Exel, xử lớ thống kờ toỏn học và tớnh toỏn trờn chương trỡnh Turbo-Pascal đó lập trỡnh sẵn cho mỗi phần.
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
III.1. Nghiờn cứu xõy dựng quy trỡnh xỏc định hàm lượng hoạt chất C6H9N3O3 trong thuốc khỏng khuẩn metrodinazole
III.1.1 khảo sỏt tỡm điều kiện tối ưu của thụng số đo của mỏy cực phổ đa năng 757 computer
III.1.1.1 Thời gian đuổi khớ
Cỏch tiến hành: dựng pipet lấy 2ml dung dịch mẫu phõn tớch metrodinazole (0,02mg/ml) và 5ml dung dịch đệm photphat pH=4,60 cho vào bỡnh định mức 25ml, thờm nước cất 2 lần tới vạch định mức điều chỉnh pH dung dịch đạt giỏ trị pH=4,60, chuyển dung dịch vào bỡnh điện phõn. Đặt cỏc trị đo ở điều kiện tối ưu đó khảo sỏt. Tiến hành đo trong khoảng thời gian : 30 – 300s, đo lặp 3 lần và lấy kết quả trung bỡnh, ghi trong bảng 3.1 và hỡnh 3.1.
Bảng 3.1. Khảo sỏt thời gian đuổi khớ oxi Thời gian đuổi khớ (s) - Ipic.10-8 (A) - E1/2 (V)
30 2,53 0,337 60 3,16 0,337 90 3,17 0,337 120 3,18 0,332 180 3,12 0,327 250 3,48 0,337 300 3,59 0,347