trong tỏch dũng và giải trỡnh tự gen.( hỡnh 7)
Hỡnh 7: Vector pGEM7+
2.4 Phương phỏp nghiờn cứu2.4.1 Kỹ thuật tỏch plasmid 2.4.1 Kỹ thuật tỏch plasmid
Để tỏch plasmid từ vi khuẩn E.coli ta thực hiện theo cỏc bước sau(8):
Nuụi vi khuẩn E.coli trong mụi trường LB lỏng khi OD khoảng 0,6 Bước 1. Cho 1 – 1,5ml dịch nuụi cấy vào ống eppendoft rồi ly tõm trong 10 phỳt.
Bước 2. Dựng pipet hỳt hết dịch nuụi cấy sau ly tõm rồi cho 100àl dung dich solution I vào ống eppendoft.
Bước 3. Cho tiếp 100 àl solution II vào ống eppendoft ở trờn sau đú dựng tay lắc nhẹ.
Bước 4. Cho 100 àl dung dịch solution III vào ống eppendoft ở trờn rồi dựng tay lắc nhẹ.
Bước 5. Ly tõm lạnh hỗn hợp trờn trong ống eppendoft khoảng 10 phỳt.
Bước 6. Dựng pipet hỳt hết dịch trong ở trờn sang ống eppendoft mới.
Bước 7. Lấy 600-800 àl Iso propanol vào ống eppendoft trờn. Bước 8. Ly tõm hỗn hợp trờn trong ống eppendoft.
Bước 9. Tỏch phần dịch lỏng phớa trờn bỏ đi.
Bước 10. Rửa sạch ADN cũn lại bằng cồn 70 0 khoảng 2 -3 lần. Bước 11. Thu ADN và bảo quản:
Sau khi rửa ta thu được ADN sạch, cho TE buffer hoặc nước cất.
2.4.2 Kỹ thuật cắt gen bằng Enzyme giới hạn
Lấy: 3àl buffer
1,5àl enzym EcoRI 1,5àl enzym Hind III 10àl ADN plasmid 14 àl nước cất Tổng thể tớch phản ứng là 30àl
Thực hiện phản ứng trong ống effenot ở 370C trong 60 phỳt.
Sau khi tiến hành cắt xong kiểm tra kết bằng điện di gen trong agarose.
2.4.3 Kỹ thuật ghộp gen bằng enzyme
Để thực hiện phản ứng ta tiến hành như sau:
Trước tiờn ta cắt vector tỏi tổ hợp pET -32a(+) bằng hai enzyme trong phản ứng cắt gen ở mục 2.4.2 là enzyme EcoRI và Hind III.
Sau đú thực hiện phản ứng theo tỷ lệ sau: 2 – 3àl ADN cần ghộp
0.5 - 1 àl Vector
1àl Enzyme ligase ( T4 Ligase) 1 àl Buffer
5,5 àl - 4 àl Nước cất
Sao cho tổng thể tớch phản ứng là 10 àl, thực hiện trong điều kiện nhiệt độ khoảng 16 – 240c, trong khoảng 60 phỳt. Sau khoảng thời gian trờn, ta lấy mẫu ra chuyển vào tế bào khả biến để kiểm tra kết quả nối gen theo kỹ thuật trỡnh bày ở dưới đõy( mục 2.4.4).
2.4.4 Kỹ thuật chuyển gen