- Thiết kế tế bào khả biến từ Ecoli XL1 Blue
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Kết Quả
3.1.3 Giải trỡnh tự gen novW
Vector pGEM 7+ cú chứa gen novW được gửi đi giải trỡnh tự gen. Và kết quả giải trỡnh tự được thể hiện như hỡnh 12.
Thụng qua kết quả giải trỡnh tự gen, ta thấy chiều dài đoạn ADN là 624 Nucleotide hoàn toàn khớp với số nucleotide cú trong gen nghiờn cứu và khụng cú sai khỏc nào.
Chiều dài của đoạn gen nhận được tương đồng với chiều dài của gen novW quy định. Từ kết quả hỡnh 12 ta thấy Gen novW cú mó khởi đầu là GTG và mó kết thỳc là TGA.
Để so sỏnh trỡnh tự gen novW, ta so sỏnh với cỏc trỡnh tự của gen Isomerase đó đang ký trờn ngõn hàng gen thế giới, thụng qua phần mềm Blast trờn trang http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Ta thấy rằng gen novW cú trỡnh tự nucleotide tương đồng với trỡnh tự cỏc nucleotide của nhúm gen isomerase đó đăng ký trờn ngõn hàng gen thế giới là 100%, cũn với chủng streptomyces roseochromogenes subsp là
98% và với chủng strepomyces rishiriensis DSM 40489 coumermycin A1 cũng là 99%.(hỡnh 13).
Và để đỏnh giỏ trỡnh tự axit amin, ta so sỏnh kết quả nhận được từ việc giả trỡnh tự gen với ngõn hàng gen thế giới thụng qua trang NCBI. Ta cũng thấy rằng gen novW cú trỡnh tự axit amin hoàn toàn tương đồng với trỡnh tự axit amin của nhúm gen cú chức năng là isomerase, đó được cụng bố trờn ngõn hàng gen thế giới, với độ tương đồng là 100%.(hỡnh 14) E.coli Bl 21 NovW W Hind III EcoRI PCR novQ novR novP
novO novS novT novU novV novW
PGEM 7+
EcoRI
Hỡnh 10: Sơ đồ chuyển gen NovW vào vector pGEM 7+ Trong đú pNovW là viết tắt của pGEM 7+-NovW
Hỡnh 11: Hỡnh ảnh chạy điện di trờn agarose của sản phẩm cắt pGEM7+-novW (pNovW)
Trong đú M: là Marker
43
3kb
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 là cỏc mẫu sản phẩm cắt pNovW tương ứng
Từ kết quả so sỏnh trỡnh tự axit amin và trỡnh tự nucleotide của
novW với cỏc trỡnh tự gen đó đăng ký trờn ngõn hàng gen thế giới tại NCBI. Ta kết luận sơ bộ rằng gen novW là gen co chức năng mó húa cho tổng hợp enzyme xỳc tỏc cho phản ứng đồng phõn húa nhúm (– CH3) trong quỏ trỡnh sinh tổng hợp đường L-novioce tại vị trớ cỏc bon số 6 của phõn tử đường.
GTGAGACTTCGCCCGCTCGGTATCGAGGGTGTCTGGGAGATCACCCCCGAGCAGCGCGCCGATCCGCGGGGGGTCTTCCTGGACTGGTATCACGTCGACCGGTTCGCCGAGGCGATC CCGATCCGCGGGGGGTCTTCCTGGACTGGTATCACGTCGACCGGTTCGCCGAGGCGATC GGCCGCCCCCTGCGGCTGGCCCAGGCCAATCTGTCGGTGTCCGTCCGCGGGGTGGTGCG CGGCATCCACTTCGTCGATGTGCCGCCGGGGCAGGCCAAGTACGTGACGTGTGTGCGC GGCGCGGTGTTCGACGTGGTGGTGGACCTGCGCGTCGGCTCGCCGACGTACGGGTGCT GGGAAGGCACCCGGCTCGACGATGTCAGCCGTCGTGCCGTCTACCTCTCGGAGGGCAT CGGGCACGGCTTCTGCGCGATCTCGGACGAGGCCACGCTGTGCTATCTGTCTTCGGGGA CCTACGACCCGGCGACCGAGCACGGTGTGCACCCGCTCGATCCCGAACTGGCCATCGA CTGGCCCACCGGGACGCCGCTGCTGTCCCCCCGCGACCAGGACGCGCTCCTGCTCGCCG AAGCCCGGGACGCCGGCCTGTTGCCGACCTACGCGACCTGTCAGGCCGTCACGGTGCC TTCACCGGCGCCGGGTTCGGTCGGAGACCCGGGCCCGTGA
Hỡnh 12: Chuỗi trỡnh tự gen novW
Hỡnh 13: Kết quả so sỏnh nucleotid
Hỡnh 14: Kết quả so sỏnh axit amin
3.1.4. Chuyển gen novW vào vector pET-32a(+)
Để thiết kế vector biểu hiện ta dựng vector pET-32a(+) là vector biểu hiện. Quỏ trỡnh chuyển gen novW vào vector pET -32a được thực hiện theo sơ đồ hỡnh 15. Để tỏch được gen novW, Ta cắt vector p-
novW( là vector pGEM7+ cú chứa đoạn gen novW) bằng hai enzyme giới hạn là EcoRI và HindIII (Theo mục 2.4.2). Đồng thời ta cũng dựng hai enzyme này cắt vector pET- 32a(+). Sau phản ứng, ta thu được đoạn gen vector pET 32a+ ở dạng thẳng. Đoạn vector pET 32a+ và đoạn gen novW được nối với nhau bằng enzyme nối T4 ADN ligase theo kỹ thuật nối gen được trỡnh bày ở mục 2.4.3 (hỡnh 18).
Sau khi nối gen, ta biến nạp sản phẩm nối gen ở trờn vào tế bào khả biến E.coli XL1 Blue và được nuụi cấy tăng sinh trong mụi trường thạch đĩa LB cú bổ sung thờm khỏng sinh Ampicilin (1mg amp/1ml LB) với nhiệt độ 37 oC, trong khoảng thời gian từ 14 đến 16. Sau khoảng thời gian trờn, đĩa thạch sẽ xuất hiện cỏc khuẩn lạc. Ta chọn từ 6- 7 khuẩn lạc nhỏ, trắng và riờng rẽ, đem nuụi riờng rẽ trong cỏc ống mụi trường LB lỏng cú bổ sung khỏng sinh( 1àl /1ml), với nhiệt độ 37độ C, trong khoảng thời gian từ 14 đến 16 giờ cho tới khi OD của dịch nuụi cấy khoảng 0,6 thỡ thực hiện tỏch plasmid theo kỹ thuật tỏch
plasmid ở mục 2.4.1. Khi thu được Plasmid, ta tinh sạch plasmid và cắt bằng hai enzyme giới hạn là EcoRI/Hind III. Kết quả cắt gen trờn được phõn tớch bằng phương phỏp điện di trờn agarose.
Thụng qua kết trờn bản quả điện di (hỡnh 16), ta thấy cú 2 vạch tương ứng với hai đoạn ADN, một đoạn cú độ dài tương đương với 5,9 kb hay ứng với độ dài của vector pET32-a(+) và một đoạn cú độ dài tương đương với 0,624 kb tương ứng với độ dài của gen novW. Điều này thể hiện rằng gen novW đó chuyển thành cụng vào vector pET -32a(+), tạo ra vector tỏi tổ hợp trờn vector pET -32a(+) là vector pET -32a(+)-novW. Vector này cú thể dựng là vector biểu hiện, để thu enzyme cho những phản ứng tiếp theo.
pET32a+ _NovW
EcoRI Hind III
Hỡnh 15: Sơ đồChuyển gen novW vào vector pET 32a+
Hỡnh 16: Hỡnh ảnh chạy điện di agarose ADN sản phẩm chuyển gen
novW vào vector pET -32a(+) Trong đú M là marker
1, 2, 3, 4, 5 là cỏc mẫu ADN tương ứng
51