- Thiết kế tế bào khả biến từ Ecoli XL1 Blue
2.4.5 Kỹ thuật thiết kế mồi và chạy PCR Thiết kế mồ
- Thiết kế mồi
Mồi là một đoạn oligonucleotide ngắn, cú chiều dài khoảng từ 6 (mồi hexanucleotide) đến 70 nucleotide, những mồi ngẫu nhiờn (mồi RAPD) cú chiều dài khoảng 10 nucleotide và đa số cỏc mồi PCR cú chiều dài khoảng 20 dến 30 nucleotide
Việc thiết kế mồi được thực hiện đơn giản nhờ trang Web: http://www.justbio.com/. Chỳng ta chi cần sử dụng trỡnh tự gen đó biết và sao chộp rồi dỏn vào là đó cú được đoạn mồi cần thiết kế, nhiệt độ gắn mồi…
Để chạy PCR gen novW ta sử dụng cặp mồi cho phản ứng là mồi xuụi (WF -5’- GAA TTC CGA TCA CGA GGA GTT GAA GGA -3’) và mồi nguợc (WR -5’- AA GCT TCA CGG GCC CGG GTC TCC GAC - 3’) - Chạy PCR Cỏc thành phần PCR • ADN 25 ng • dNTP 200 mM • Mồi PCR (PCR primer) 200 mM • MgCl2 1.5 mM • Đệm PCR 1X*
• Enzym Taq polymerase 1 đơn vị
• Thể tớch phản ứng 10ml đến 20ml Quy trỡnh PCR bao gồm cỏc bước sau:
Bước 1: Khởi đầu đun hỗn hợp ở 96°C trong vũng 5 phỳt để đảm bảo sợi ADN cũng như mồi được làm núng. ADN-Polymerase cú thể cú trong giai đoạn khởi đầu, hoặc nú cú thể được thờm vào ngay sau bước này.
Bước 2: Biến tớnh (Melting). 96°C trong 30 giõy. Đối với mỗi chu kỡ thỡ lượng thời gian này là đủ để biến tớnh ADN.
Bước 3: Gắn mồi (Annealing) 68°C trong 30 giõy. Bước 4: Kộo dài (Elongation) 72°C trong 45 giõy.
Bước 5: Cỏc bước từ 2 đến 4 được lặp lại 25 lần, tuy nhiờn với mồi và polymerase tốt, 15 đến 20 chu kỳ cú thể là đủ.
Bước 6: Giữ hỗn hợp ở 7°C. Tại nhiệt độ này ADN sẽ khụng bị hư hại trong vũng 1 đờm.