2.1.1. Mẫu cây
Các mẫu thực vật của họ Na (Annonaceae) và họ Sim (Myrtaceae) được thu hái tại các tỉnh Hà Tĩnh và Ninh Bình và được TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh Thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam giám định (hình 1). Các mẫu được lưu giữ tại phịng Sinh học Thực nghiệm, Viện Hĩa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện KH & CN Việt Nam.
2.1.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định
Các chủng VSVKĐ hiện đang được lưu giữ tại phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hố học các hợp chất thiên nhiên (hình 3):
- Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtilis ATCC 27212. Staphylococcus aureus ATCC 12222
- Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli ATCC 25922.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923
- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754.
Candida albicans SH 20
- Nấm mốc: Aspergillus niger 439.
Fusarium oxysporum M42
2.1.3. Dịng tế bào
Dịng Hep- G2: Hepatocellular carcinoma - tế bào ung thư gan ở người hiện đang được lưu giữ tại phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hố học các hợp chất thiên nhiên.
2.2. NGUYÊN LIỆU 2.2.1. Hố chất, dụng cụ
+ Các hĩa chất đa lượng và vi lượng dùng làm mơi trường nuơi cấy trong phịng thí nghiệm của phịng Sinh học Thực nghiệm, viện Hĩa các hợp chất thiên nhiên cĩ nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam.
+ Các hĩa chất dùng trong phịng thí nghiệm thử hoạt tính kháng sinh, hoạt tính ức chế một số dịng ung thư được nhập từ Trung Quốc, Đức, Mỹ.
+ Sắc ký cột: sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 100-160 mesh và cỡ hạt 0,063- 0,200 mesh.
+ Dung mơi để chạy cột và tách chiết: n-hexan, etylaxetat, metanol, clorofoc, axetol… Tất cả các dung mơi chạy sắc ký đều được cất lại và làm khan trước khi sử dụng.
+ Phiến vi lượng 96 giếng, bình tam giác (250ml), ống nghiệm, đĩa petri, pipet, micropipet...
2.2.2. Thiết bị
Các dụng cụ thiết bị và máy mĩc của phịng Sinh học thực nghiệm- Viện Hố học các Hợp chất thiên nhiên: tủ cấy vi sinh vật – Box Laminar PII (Đức), tủ lạnh, tủ ấm CO2-Sanyo, máy li tâm - Sigma (Mỹ), máy đọc ELISA – Labsystems Multiskan MS (Thụy sĩ), cân điện tử AL3000 (Mỹ), nồi khử trùng Lequenx (Pháp).
Điểm nĩng chảy được đo trên máy BOTIUS (Heiztisch Mikroskop) của Đức. Phổ khối ion hố bụi electron ESI-MS: được đo trên máy Thermo Finnigan LCQ Avantage spectrometer. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- (500MHZ), 13H- (125MHZ) và DEPT được ghi trên máy Bruker AM500-FT-NMR sử dụng TMS làm chất chuẩn.
2.2.3. Mơi trường
2.2.3.1. Mơi trường nuơi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật theo phương pháp pha lỗng liên tục trên phiến vi lượng 96 giếng
+ Mơi trường thạch thường: Cao thịt 2,5g; Pepton 10g; NaCl 5g; Agar 20g, Nước cất 1000ml.
+ Mơi trường Hanxen: Tinh bột tan 10g; Cao nấm men 1g; Glucoza 50g; Pepton 10g; KH2PO4 3g; MgSO4.7H2O 3g; Agar 20g; Nước cất 1000ml.
+ Mơi trường Czapek-dox: Saccaroza 30g; NaNO3 2g; KH2PO4 1g; MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g; Agar 20g; Nước cất 1000ml.
+ Mơi trường (nuơi cấy vi khuẩn): Mơi trường Eurgon Broth (Difco, Mĩ) + Mơi trường thử hoạt tính nấm: Mơi trường Mycophil (Difco, Mĩ)
2.2.3.2. Mơi trường nuơi cấy các dịng tế bào ung thư
Mơi trường MEME (Minineal Essential Medium with Eagle’s salts) bổ sung 7-10% huyết thanh bê tươi, 1% dịch kháng sinh (PSF) và 1% NAA (Nonessential Amino Axit). Hoặc mơi trường DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium): 10% huyết thanh bê tươi, 1% dịch kháng sinh (PSF), 1% NAA.
Dịch kháng sinh PSF: 100đơn vị/ ml Penicilin
100µg /ml Streptomycin sulfate 0,25µg /ml Amphotericin B
Đệm PBS: NaCl 8g; KCl 0,2g; Na2HPO4 1,15g; KH2PO4 0,2g; nước cất 1L; khử trùng 1 at/30 phút.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và tách chiết sơ bộ
Mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi khơ trong bĩng râm và sấy khơ ở nhiệt độ 45 – 500C, sau đĩ được nghiền nhỏ. Bột mẫu khơ ngâm chiết bằng metanol ở nhiệt độ phịng. Dịch chiết metanol được cất loại dung mơi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết. Cặn chiết MeOH được thử hoạt tính kháng VSVKĐ, gây độc tế bào và chống oxy hĩa.
Nghiền mẫu + ngâm chiết bằng dung mơi metanol (MeOH)
Lọc
Cất loại dung mơi dưới áp suất giảm
Sơ đồ1: Sơ đồ chiết hĩa học bằng metanol các mẫu Na – Sim
Cặn chiết MeOH nếu cĩ hoạt tính, tùy theo các định hướng ngiên cứu hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào hay chống oxy mà cĩ phương pháp nghiên cứu tiếp theo. Chúng tơi đã chọn mẫu SV01 tiến hành chiết phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học các cặn chiết đã phân đoạn để cĩ hướng nghiên cứu hĩa học sâu hơn theo định hướng hoạt tính sinh học. Mẫu được chiết phân đoạn theo phương pháp sắc ký cột sử dụng silicagel Merck 60, dung mơi chạy cột: n-hexan, metanol, clorofoc, axetol.
Mẫu Na - Sim
Dịch chiết MeOH
Bã Cặn chiết MeOH Thử hoạt
tính sinh học
2.3.2. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.3.2.1. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity).
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và Kane L., & Kandel (1996), hiện đang được áp dụng tại trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. [19]
Các chủng kiểm định đã được nêu ở phần nguyên liệu mục 2.1.2.
Đối chứng dương tính: các kháng sinh bao gồm + Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+)
+ Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-)
+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men
Kháng sinh pha trong DMSO100% với nồng độ thích hợp: Ampixilin: 50mM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0.04mM
Đối chứng âm tính
VSVKĐ khơng trộn kháng sinh và chất thử
Bước1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất cĩ hoạt tính, bao gồm các thủ tục sau đây:
Chuẩn bị VSVKĐ
Các chủng kiểm định được duy trì trong mơi trường: thạch dinh dưỡng đối với vi khuẩn; Haxen đối với nấm men và Czapek - Dox đối với nấm mốc. Trước khi tiến hành thí nghiệm các chủng VSVKĐ được hoạt hĩa trong các mơi trường dinh dưỡng dịch thể: MT Eugon Broth cho vi khuẩn và Mycophyl cho nấm (ủ 24 giờ ở 37°C đối với vi khuẩn, 48 giờ ở 30°C đối với nấm). Sau đĩ được pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 108 vi sinh vật/ ml). Để trong tủ ấm 370C/24h đối với vi khuẩn và 300C/48h đối với nấm.
Chuẩn bị mẫu thử
Hịa tan mẫu thử bằng dung mơi DMSO với nồng độ 8mg/ml đối với chất thơ, 2mg/ml đối với chất tinh.
Tiến hàng thí nghiệm
Dãy thí nghiệm: mẫu thử + 190 µl VSVKĐ đã được hoạt hĩa Dãy đối chứng 1: 190 µl mơi trường nuơi VSVKĐ
Dãy đối chứng 2: DMSO + 190 µl VSVKĐ đã được hoạt hĩa Dãy đối chứng 3: kháng sinh + 190 µl VSVKĐ đã được hoạt hĩa Dãy đối chứng 4: 190 µl VSVKĐ đã được hoạt hĩa
Đọc kết quả
Mẫu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt, khơng cĩ vi sinh vật sinh trưởng, giống như hình ảnh ở các giếng chứng âm tính. Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC.
Bước2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu thử cĩ hoạt tính với các thủ tục tiến hành như bước 1. Các mẫu cĩ hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha lỗng theo các thang nồng độ thấp dần, 5-10 thang nồng độ, để tính giá trị tối thiểu MIC mà ở đĩ vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hồn tồn.
Đọc kết quả
Nồng độ dương tính là ở đĩ khơng cĩ vi sinh vật sinh trưởng. Khi nuơi cấy lại nồng độ này trên mơi trường thạch đĩa để kiểm tra, cĩ giá trị CFU < 5.
Mẫu thơ cĩ giá trị MIC ≤ 200µg/ml; mẫu tinh cĩ giá trị MIC ≤ 50µg/ml là cĩ hoạt tính
2.3.2.2. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)
Theo phương pháp của Likhiwitayawuid và cs., 1993 đang được tiến hành tại viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI). Dựa trên phương pháp nuơi cấy tế bào ung thư invitro của các tác giả Geran và cs, 1972; Pezutto và cs., 1983
và Skehan và cs, 1990 [20]. Phương pháp này đã được phịng Sinh học Thực nghiệm - Viện Hố học các hợp chất thiên nhiên, triển khai áp dụng từ năm 1996.Dịng tế bào đã được ghi ở phần 2.1.3.
Dịng tế bào được giữ trong nitơ lỏng, hoạt hĩa và duy trì trong các mơi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DEME cĩ bổ sung huyết thanh bê tươi 7-10%
Tế bào nuơi cấy trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; độ ẩm 98%; nhiệt độ ổn định ở 37oC vơ trùng tuyệt đối) thay mơi trường sạch để hoạt hố tế bào từ 18-24 giờ trước khi được dùng để thực hiện thí nghiệm.
Tế bào được xử lý tripsin cho tách khỏi đáy bình. Tạo huyền phù tế bào bằng mơi trường sạch, rửa và đếm số lượng, pha tế bào nồng độ 3-5x104 tế bào/ml.
Mẫu thí nghiệm
Hồ mẫu thử bằng dung dịch DMSO với nồng độ 8mg/ml đối với chất thơ, 2mg/ml đối với chất tinh. Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị IC50.
Đối chứng dương
Dùng chất chuẩn cĩ khả năng diệt tế bào, Elipitine hoặc Colchicine pha trong DMSO với nồng độ 0.01mM
Đối chứng âm
Là dung mơi DMSO 10%
Tiến hành:
Nhở 190 µl dịch huyền phù tế bào vào các giếng đã cĩ mẫu thử. Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 370C trong 3 ngày.
Kết thúc thí nghiệm: Tế bào khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khơ, nhuộm SRB 0,4% trong axit acetic 1% và rửa lại
bằng axit acetic 1% để loại mầu thừa; để khơ, hồ lại bằng dung dịch đệm Tris base.
Đọc trên máy ELISA ở bước sĩng 495-515mm
Chú ý: Luơn phải cĩ phiến đối chứng OD (0 ngày) để làm đối chứng cho lượng tế bào ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm. Về đối chứng âm: Giá trị OD của DMSO 10% để làm đối chứng cho giá trị của lượng tế bào khi kết thúc thí nghiệm. Phiến đối chứng OD 0 ngày cĩ chứa dịch huyền phù tế bào trong các giếng, để tủ ấm CO2 ở 370C trong 30 phút. Cách cố định và nhuộm như trên.
* Sàng lọc tìm giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sĩt của tế bào ở nồng độ nào đĩ của chất thử tính theo % so với đối chứng, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% ở nồng độ mẫu 40µg/ml đối với mẫu thơ và 10µg/ml đối với mẫu tinh khiết được đánh giá là cĩ hoạt tính. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (0 ngày), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo cơng thức:
OD (mẫu) – OD ( 0 ngày )
CS% = x 100
OD (DMSO) – OD (0 ngày)
CS % được tính tốn theo cơng thức độ lệch tiêu chuẩn của Ducan lấy giá trị trung bình với độ lệch tiêu chuẩn σ
Σ (xi - x )2
σ = n - 1 Trong đĩ: xi - giá trị tại giếng i
x - giá trị trung bình n - số giếng thử lặp lại
2.3.2.3. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hố thơng qua phản ứng bao vâygốc tự do tạo bởi DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Antioxydant assay) gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Antioxydant assay)
Theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và cs (2003).
Nguyên lý: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) cĩ khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hồ. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất cĩ khả năng làm trung hồ hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ơxy hố được đánh giá thơng qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sĩng 515nm.
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm
Tạo dung dịch cĩ các gốc tự do: DPPH 300µM trong ethanol (12,45mg DPPH/100ml EtOH 96%). Mẫu pha trong DMSO 100% với nồng độ ban đầu là 8mg/ml với chất thơ; 2mg/ml với chất tinh.
Đối chứng dương tính: 5mM axit acscorbic trong DMSO10%.
Tiến hành thí nghiệm
Trộn mẫu và DPPH trên phiến 96 giếng:
Dãy thí nghiệm: mẫu thử +190µl DPPH pha trong ethanol
Dãy đối chứng âm tính: DMSO 10% + 190µl DPPH pha trong ethanol Dãy blank: mẫu + 190µl ethanol
Dãy đối chứng dương tính: axit acscorbic + 190µl DPPH pha trong ethanol Phiến được bọc kín để tránh ánh sáng mơi trường và ủ trong tủ ấm 370C trong 2 giờ.
Đọc kết quả trên máy Elisa bước sĩng 515nm.
Tính giá trị % hoạt động SC% (Scavenging capacity):
Giá trị trung bình của SC% Được đưa vào chương trình xử lý số liệu exell window tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo cơng thức
OD thí nghiệm - OD mẫu trắng
SC% = [100 - x 100] ± σ
OD chứng âm tính
SC% được tính tốn theo cơng thức độ lệch tiêu chuẩn của Ducan lấy giá trị trung bình với độ lệch tiêu chuẩn σ
Σ (xi - x )2
σ = n - 1 Trong đĩ: xi - giá trị tại giếng i
x - giá trị trung bình
n - số giếng thử lặp lại
Những mẫu cĩ giá trị hoạt động SC% >50% được coi là cĩ biểu hiện hoạt tính sẽ được chọn ra để thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50
Tìm giá trị ức chế SC50
Pha mẫu theo 5 thang nồng độ, nhỏ mẫu vào phiến và tiến hành như trên, giá trị SC% được đưa vào chương trình table curve, thơng qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử tính ra nồng độ của chất thử nghiệm mà ở đĩ 50% các gốc tự do được taọ bởi DPPH được trung hồ bởi chất thử theo cơng thức:
1/y=a+blnX
y - nồng độ chất thử X - Giá trị SC(%)
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC SƠ BỘ CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÁC MẪU THỰC VẬT HỌ NA VÀ HỌ SIM CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÁC MẪU THỰC VẬT HỌ NA VÀ HỌ SIM
3.1.1. Kết quả tách chiết hĩa học các mẫu thực vật từ họ Na và họ Sim
Danh sách cây được lựa chọn:
Trong số các cây thuộc họ na và họ sim hiện đang lưu giữ tai phịng sinh học thực nghiệm, chúng tơi đã chọn ra được 5 đại diện thuộc họ Na và 5 đại diện họ Sim, là những đại diện chưa cĩ nhiều cơng bố, danh sách các đại diện được ghi lại trong bảng sau:
Bảng 3.1. Danh sách các đại diện cây thuộc họ Na và họ Sim được lựa chọn Kí hiệu
mẫu Tên khoa học
Tên
Việt Nam Họ
Nơi lấy mẫu
SV01 Desmos chinensisLuor Giẻ Trung
Quốc Annonaceae Ninh Bình
SV02 Uvaria hamiltonii Hook.f
& Thoms..
Bồ quả
Hamilton Annonaceae Ninh Bình
SV03 Fissistigma bracteolatum Chatterjee
Mãn sơn
hương Annonaceae Ninh Bình
SV04 Artabotrys intermedius
Hassk.
Cơng chúa
trung gian Annonaceae Ninh Bình
SV05 Annona reticulata L Bình bát Annonaceae Hà Tĩnh
SV06 Syzygium sterophyllum Merr. et Perry
Trâm lá
cứng Myrtaceae Hà Tĩnh
SV07 Syzygium cinereum (Kurz)
Chanlar Trâm sẻ Myrtaceae Hà Tĩnh
SV08 Syzygium zeylanicum (L.) DC
Trâm tích
SV09 Syzygium lineatum
(Blume) Merr et Perry Trâm khế Myrtaceae Hà Tĩnh
SV10 Syzygium corticosum
(Lour.) Merr. et Perry Trâm bội Myrtaceae Hà Tĩnh
Chúng tơi đã tiến hành tách chiết hĩa học các mẫu thực vật từ hai họ Na và họ Sim bằng dung mơi metanol theo sơ đồ 1. Sau khi cất loại dung mơi dưới áp suất giảm và thu được 10 dịch chiết MeOH tương ứng với 10 mẫu thực vật được nghiên cứu theo sơ đồ 1 ở phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu. Các dịch chiết được đem thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, thử khả năng gây độc tế bào và thử hoạt tính chống oxy hố.
3.1.2. Hoạt tính kháng VSVKĐ của các dịch chiết
Chúng tơi đã xác định hoạt tính kháng VSVKĐ 10 dịch chiết thơ MeOH của các mẫu Na – Sim bằng cách đo nồng độ ức chế tối thiểu MIC theo phương pháp của tác giả D.A.Vander Bergher và A.,J. Vlietlinck nêu ở phần 2.3.2.1. Mẫu thử được pha lỗng liên tục trên phiến vi lượng 96 giếng theo các thang nồng độ khác nhau. Hình 2 là ảnh chụp phiến vi lượng trong phép thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng VSVKĐ dịch chiết thơ MeOH của các mẫu thực vật từ họ Na và họ Sim