Theo phương pháp của Likhiwitayawuid và cs., 1993 đang được tiến hành tại viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI). Dựa trên phương pháp nuơi cấy tế bào ung thư invitro của các tác giả Geran và cs, 1972; Pezutto và cs., 1983
và Skehan và cs, 1990 [20]. Phương pháp này đã được phịng Sinh học Thực nghiệm - Viện Hố học các hợp chất thiên nhiên, triển khai áp dụng từ năm 1996.Dịng tế bào đã được ghi ở phần 2.1.3.
Dịng tế bào được giữ trong nitơ lỏng, hoạt hĩa và duy trì trong các mơi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DEME cĩ bổ sung huyết thanh bê tươi 7-10%
Tế bào nuơi cấy trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; độ ẩm 98%; nhiệt độ ổn định ở 37oC vơ trùng tuyệt đối) thay mơi trường sạch để hoạt hố tế bào từ 18-24 giờ trước khi được dùng để thực hiện thí nghiệm.
Tế bào được xử lý tripsin cho tách khỏi đáy bình. Tạo huyền phù tế bào bằng mơi trường sạch, rửa và đếm số lượng, pha tế bào nồng độ 3-5x104 tế bào/ml.
Mẫu thí nghiệm
Hồ mẫu thử bằng dung dịch DMSO với nồng độ 8mg/ml đối với chất thơ, 2mg/ml đối với chất tinh. Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị IC50.
Đối chứng dương
Dùng chất chuẩn cĩ khả năng diệt tế bào, Elipitine hoặc Colchicine pha trong DMSO với nồng độ 0.01mM
Đối chứng âm
Là dung mơi DMSO 10%
Tiến hành:
Nhở 190 µl dịch huyền phù tế bào vào các giếng đã cĩ mẫu thử. Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 370C trong 3 ngày.
Kết thúc thí nghiệm: Tế bào khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khơ, nhuộm SRB 0,4% trong axit acetic 1% và rửa lại
bằng axit acetic 1% để loại mầu thừa; để khơ, hồ lại bằng dung dịch đệm Tris base.
Đọc trên máy ELISA ở bước sĩng 495-515mm
Chú ý: Luơn phải cĩ phiến đối chứng OD (0 ngày) để làm đối chứng cho lượng tế bào ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm. Về đối chứng âm: Giá trị OD của DMSO 10% để làm đối chứng cho giá trị của lượng tế bào khi kết thúc thí nghiệm. Phiến đối chứng OD 0 ngày cĩ chứa dịch huyền phù tế bào trong các giếng, để tủ ấm CO2 ở 370C trong 30 phút. Cách cố định và nhuộm như trên.
* Sàng lọc tìm giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sĩt của tế bào ở nồng độ nào đĩ của chất thử tính theo % so với đối chứng, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% ở nồng độ mẫu 40µg/ml đối với mẫu thơ và 10µg/ml đối với mẫu tinh khiết được đánh giá là cĩ hoạt tính. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (0 ngày), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo cơng thức:
OD (mẫu) – OD ( 0 ngày )
CS% = x 100
OD (DMSO) – OD (0 ngày)
CS % được tính tốn theo cơng thức độ lệch tiêu chuẩn của Ducan lấy giá trị trung bình với độ lệch tiêu chuẩn σ
Σ (xi - x )2
σ = n - 1 Trong đĩ: xi - giá trị tại giếng i
x - giá trị trung bình n - số giếng thử lặp lại