gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Antioxydant assay)
Theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và cs (2003).
Nguyên lý: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) cĩ khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hồ. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất cĩ khả năng làm trung hồ hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ơxy hố được đánh giá thơng qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sĩng 515nm.
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm
Tạo dung dịch cĩ các gốc tự do: DPPH 300µM trong ethanol (12,45mg DPPH/100ml EtOH 96%). Mẫu pha trong DMSO 100% với nồng độ ban đầu là 8mg/ml với chất thơ; 2mg/ml với chất tinh.
Đối chứng dương tính: 5mM axit acscorbic trong DMSO10%.
Tiến hành thí nghiệm
Trộn mẫu và DPPH trên phiến 96 giếng:
Dãy thí nghiệm: mẫu thử +190µl DPPH pha trong ethanol
Dãy đối chứng âm tính: DMSO 10% + 190µl DPPH pha trong ethanol Dãy blank: mẫu + 190µl ethanol
Dãy đối chứng dương tính: axit acscorbic + 190µl DPPH pha trong ethanol Phiến được bọc kín để tránh ánh sáng mơi trường và ủ trong tủ ấm 370C trong 2 giờ.
Đọc kết quả trên máy Elisa bước sĩng 515nm.
Tính giá trị % hoạt động SC% (Scavenging capacity):
Giá trị trung bình của SC% Được đưa vào chương trình xử lý số liệu exell window tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo cơng thức
OD thí nghiệm - OD mẫu trắng
SC% = [100 - x 100] ± σ
OD chứng âm tính
SC% được tính tốn theo cơng thức độ lệch tiêu chuẩn của Ducan lấy giá trị trung bình với độ lệch tiêu chuẩn σ
Σ (xi - x )2
σ = n - 1 Trong đĩ: xi - giá trị tại giếng i
x - giá trị trung bình
n - số giếng thử lặp lại
Những mẫu cĩ giá trị hoạt động SC% >50% được coi là cĩ biểu hiện hoạt tính sẽ được chọn ra để thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50
Tìm giá trị ức chế SC50
Pha mẫu theo 5 thang nồng độ, nhỏ mẫu vào phiến và tiến hành như trên, giá trị SC% được đưa vào chương trình table curve, thơng qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử tính ra nồng độ của chất thử nghiệm mà ở đĩ 50% các gốc tự do được taọ bởi DPPH được trung hồ bởi chất thử theo cơng thức:
1/y=a+blnX
y - nồng độ chất thử X - Giá trị SC(%)
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN