3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
2.9.PHƯƠNGPHÁP TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH GEN
Tách dòng và giải trình tự gen 18S RNA Ribosome của mẫu
Varicorhinus lepturus ở Tương Dương mẫu (TD1); Varicorhinus microtomus
ở Quỳ Hợp(QH16); Varicorhinus gerlachi ở Con Cuông(CC21); Varicorhinus laticeps ở Thanh Chương(TC25)( kí hiệu mẫu TD-DHVinh; QH - DHVinh; TC và CC).
* Hóa chất và thiết bị máy móc
- Các loại hóa chất: Chỉ thị phân tử DNA (Invitrogen, Mỹ); Taq DNA polymerase (Perkin Elmer, Cetus, Mỹ); Agarose (Gibco BRL Life Technologies, Mỹ); Tris base, EDTA (Amersham Biosci, Anh) và các hóa chất thông dụng khác.
- Các loại thiết bị máy móc: máy quang phổ tự ngoại - UV- 1650 PC(Shimadzu, Nhật bản); Máy li tâm Legend RT (Sorvall, Mỹ); Máy li tâm Biofuge Fresco (Sorvall, Mỹ) máy PCR- ABI 9700 (Applied Biosystems, Mỹ); Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100, Applied Biosystems, Mỹ); Máy điện di power Pac 300, máy soi DNA (Bio-Rad, Mỹ); Máy đo pH Meter Delta 320 (Mettler Toledo, Thụy sĩ)
* Tách dòng và xác định trình tự được thưc hiện qua các bước sau: - Tách chiết DNA Genom từ cá:
Tách chiết DNA Genom từ cá được tiến hành theo phương pháp tách chiết DNA từ mô động vật, được Ausubel F.et al.mô tả (1995)
- Kỹ thuật PCR để khuyếch đại đoạn gen 18S ARN Ribosome từ cá: - Cặp mồi dùng để khuyến đại gen mã hóa 18S ARN Ribosome từ cá: - Cặp mồi 18Sp1, 18Sp2 dùng để khuyếch đại đoạn gen 18S ARN Ribosome từ cá có trình tự sau:
18Sp1: 5’ - GAGAGGGAGCCPGAGAAACG - 3’ 18Sp2: 5’ - GGCATCACAGACCTGTTATTGC - 3’ Các mồi được tổng hợp nhờ hãng Invitrogen (Mỹ)
- Tách dòng và giải trình tự gen 18S ARN Ribosome của cá.
- Tách dòng đoạn gen mã hóa 18S ARN Ribosome của cá được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR® 2.1 với việc sử dụng bộ sinh phẩm tách dòng của hãng Invitrogen.
- Tiếp theo sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bào Ecoli chủng INV αF’. Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicilline và X - gal, sau đó ủ ở 37 C qua đêm. Các khuẩn lạc Ecoli chứa vectơ pCR® 2.1 Tái tổ hợp mang sản phẩm PCR sẽ có màu trắng.
+ Chuẩn bị tế bào khả biến Ecoli để biến nạp băng sốc nhiệt - Biến nạp DNA Plasmit vào tế bào vi khuẩn
- Tách chiết DNA plasmid - Tinh sạch plasmid tái tổ hợp
- Xác định trình tự gen bằng máy tự động
- Xử lý số liệu bằng phần mềm vi tính chuyên dụng
Sau khi giải trình tự, kết quả được phân tích bằng các chương trình phần mềm GENDOC và PC/Gene. Trình tự được so sánh trên mạng nhờ chương trình Blast và đăng ký vào ngân hàng gen quốc tế.
(Các phương pháp này được thực hiện tại Phòng Di truyền Vi sinh - Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)