3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
3.4. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN
Kết quả tách dòng và giải trình tự 4 mẫu (Varicorhinus lepturus; Varicorhinus microtomus; Varicorhinus gerlach;Varicorhinus laticeps. Thông thường người ta dùng 100ng cho một mẫu phản ứng PCR. Vì vậy cần pha loãng DNA của các mẫu cá đã tách chiết được trong nước khử ion vô trùng để có 50 ng/µl và sử dụng 2 µl cho mỗi phản ứng PCR.
Sản phẩm DNA đã tách chiết cũng được kiểm tra bằng điện li trên gel agarose1%. Kết quả điện li các mẫu DNA tách chiết từ TD-DHVinh; QH- DHVinh; TC và CC.
Qua kết quả cho thấy DNA của các mẫu không bị đứt gãy và tương đối sạch. Vì vây có thể sử dụng cho khuyếch đại đoạn gen 18S rARN Ribosome bằng kỹ thật PCR.
* Khuyếch đại, tạo dòng và xác định trình tự đoạn gen 18S ARN ribosome của TD-DHVinh; QH-DHVinh; TC và CC;
Tiến hành tạo dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa 18S rARN Ribosome Ribosome (Gen18S rARN ) để có thể bổ sung những thông tin về mặt di truyền của các loài cá và bước đầu ứng dụng sinh học phân tử trong xác định loài. Như chúng ta đã biết , gen 18s rRNA là gen bảo thủ của các sinh vật nhân chuẩn (Eucaryote). Sự thay đổi trình tự của gen này phản ánh quan hệ chủng loại và cung cấp các thông tin rất quan trọng về mức độ gần gũi hay khác biệt giữa các loài. Những thông tin về trình tự gen 18S rRNA còn cho phép thiết lập các phương pháp định loài nhanh bằng sinh học phân tử. Sử dụng DNA đã tách chiết 4 mẫu cá thuộc để khuyếch đại đoạn gen 18S rRNA. Cặp mồi được sử dụng được thiết kế nằm trong vùng bảo thủ của gen 18 S rRNA (Ausubel F. et al., 1995). Theo lý thuyết cặp mồi này có thể khuếch đại được đoạn gen 18S rRNA của các loại sinh vật khác nhau có nhân chuẩn.
Hình 3.13: Kết quả khuếch đại đoạn gen 18S rRNA
Kết quả ở cho thấy với cặp mồi 18S p1, 18S p2, sản phẩm PCR thu được là rất đặc hiệu.Sản phẩm PCR được tạo dòng bằng phương pháp găn trực tiếp vào vectơ tạo dong PCR® 2.1 của hãng Invitrogen sau đó biến nạp vào trực khuẩn Ecoli để chọn các plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18s rRNA của từng dòng mọt. Các plasmid tái tổ hợp được chọn bằng phương pháp xử lý với emzyme hạn chế EcoRI. Kết quả kiểm tra để chọn các plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA của các mẫu cá thuộc được nêu trên.
Dùng S.N.A.P Miniprep kit do hãng Invitrogen cung cấp để tinh sạch các plasmid. Các plasmid sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1%. Kết quả kiểm tra các plasmid sau khi tinh sạch.
Hình 3.15: Kết quả kiểm tra các plasmid sau khi tinh sạch
Sau khi tinh sạch các đoạn AND đính chèn vào các plasmid đã được giải trình tự nhờ máy xác định trình AND tự động ABI 3100 (Applied Biosystems) như đã nêu ở các phần vật liệu và phương pháp. Trình tự đoạn gen 18S rRNA sau khi được phân tích bằng chương trình phần mềm PC/gene. Kết thu được các trình tự gen 18s của 4 loài: Varicorhinus microtomus, Varicorhinus lepturu,; Varicorhinus laticeps, Varicorhinus gerlachi.