Tớnh độc biểu thị bằng LD50 là liều lượng cần thiết gõy chết 50% cỏ thể thớ nghiệm (chuột bạch) tớnh bằng đơn vị mg/kg thể trọng. LD50 càng nhỏ thỡ độc lực càng cao [20].
Trong phũng thớ nghiệm, để diễn tả độc lực của mầm bệnh người ta quy ước dựng liều ớt nhất cú thể gõy chết, ký hiệu là DLM (dosis lethalis minima), tức là dựng số lượng ớt nhất nuụi trong những điều kiện nhất định về mụi trường, nhiệt độ và thời gian cú thể giết chết một động vật nhất định. Tuy nhiờn, do chịu ảnh hưởng quỏ mạnh của tớnh đề khỏng cỏ thể của động vật thớ nghiệm đại lượng này rất khú xỏc định. Do đú trờn thực tế, để cú thể xỏc định
độc lực một cỏch chớnh xỏc hơn (và ổn định hơn), người ta thường dựng liều gõy chết 50% số động vật thớ nghiệm (ký hiệu LD50 - mean lethal dose), cũn đối với những chất độc khụng thể gõy chết động vật mà chỉ gõy bệnh món tớnh thỡ người ta sử dụng liều gõy nhiễm 50% (ID50 - mean infective dose). Đương nhiờn, do biểu hiện độc tớnh của cỏc loại thuốc chịu ảnh hưởng mạnh từ phớa ký chủ nờn biểu thị độc lực của một loại thuốc thường phải nờu rừ loại động vật thớ nghiệm. Người ta cú thể ghi "mỗi ml dịch thuốc chứa bao nhiờu LD50 đối với chuột nhắt trắng sơ sinh" nhưng mặt khỏc người ta cũng cú thể xỏc định nồng độ thuốc tạo nờn một liều gõy chết trung bỡnh đú. Để xỏc định LD50 người ta cú một số phương phỏp, trong đú thường sử dụng phương phỏp Reed và Muench. Phương phỏp này cú ưu điểm sử dụng một số lượng khỏ ớt động vật thớ nghiệm.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Đối tượng nghiờn cứu
- Hạt keo giậu (Leucaena leucocephala). - Giun đầu múc (Acanthocephala).
2.2. Vật liệu nghiờn cứu
- Dụng cụ bố trớ thớ nghiệm: Cỏc đĩa petri.
- Dụnh cụ thu mẫu: Bộ dao kộo mổ cỏ, khay men, găng tay, panh, . . .. - Dụng cụ quan sỏt: Kớnh hiển vi, kớnh lỳp.
- Dụng cụ chiết xuất dịch chiết hạt keo: mỏy xay sinh tố, chai lọ, lưới lọc, cốc đong, đũa thủy tinh, . . .
2.3. Nội dung nghiờn cứu
- Xỏc định cơ quan cảm nhiễm của giun trờn cỏc loài cỏ nước ngọt. - Nghiờn cứu khả năng diệt giun của dịch chiết hạt keo và Bokasshi hạt keo. - Nghiờn cứu khả năng gõy độc của dịch chiết hạt keo và Bokasshi hạt keo lờn cỏ nước ngọt.
2.4. Phương phỏp nghiờn cứu
2.4.1. Phương phỏp thu mẫu
- Mẫu cỏ thu về phũng thớ nghiệm phải cũn sống, nguyờn vẹn khụng xõy xỏt. - Mẫu phải được phõn tớch và xử lý trong vũng 1 giờ
2.4.2. Phương phỏp xử lớ mẫu
- Cõn khối lượng và đo chiều dài, sau đú tiến hành giải phẩu nội tạng để xỏc định cơ quan cảm nhiễm của cỏc loài cỏ.
- Dựng kộo và dao mổ cắt mổ cỏ lấy ruột.
- Cắt dọc từng đoạn ruột cho vào cỏc đĩa petri cú chứa 20ml dịch chiết hạt keo tươi hoặc Bokashi hạt keo.
2.4.3. Phương phỏp sản xuất Bokashi keo
2.4.3.1. Phương phỏp sản xuất EM thứ cấp * Nguyờn liệu: - Nước 7 ( Lớt) - Rỉ đường 0,5l - Dấm 0,5l - Cồn 1L - EM1 1L
Nước phải sạch, là nước ngầm hoặc nước mỏy đó khử hết Clo. Dấm tự nhiờn tốt hơn dấm húa học.
Cồn (C2H5OH): 400 - 450.
* Phương phỏp pha chế
- Trộn rỉ đường với nước trước để hũa tan hết rỉ đường. - Đổ dấm, cồn vào theo đỳng tỉ lệ, chỳ ý lắc cho thật đều.
- Đổ EM1 vào hỗn hợp và lắc đều. Đậy nắp kớn, ủ trong can nhựa và duy trỡ ở điều kiện kỵ khớ.
Chỳ ý: Khi pha chế thỡ EM1 luụn luụn phải pha sau cựng để trỏnh sự tiờu diệt cỏc vi khuẩn cú lợi. EM thứ cấp cú mựi thơm ngọt của hoa quả là cú chất lượng tốt. Duy trỡ ổn định nhiệt độ, EM được sử dụng sau 3 ngày và cú thể dựng được trong vũng 3 thỏng.
2.4.3.2. Phương phỏp tỏch chiết hoạt chất từ hạt keo và sản xuất Bokashi keo * Phương phỏp tỏch chiết hoạt chất từ hạt keo
- Keo tươi tỏch lấy hạt, cõn trọng lượng và ngõm với dung mụi (nước cất hoặc Ethanol) với tỷ lệ 1: 2 rồi cho vào mỏy xay xay thật nhuyễn.
- Để hỗn hợp hạt keo và dung mụi trong điều kiện kỵ khớ, ở nhiệt độ 25 - 300. 3 ngày sau đú vắt lấy dịch chiết, lọc qua lưới lọc.
- Bảo quản ở nhiệt độ 25 - 300C, trong điều kiện kỵ khớ.
* Phương phỏp sản xuất Bokashi keo
- Hạt keo tươi được trộn với EM thứ cấp theo tỉ lệ 1:2 rồi xay nhuyễn. - Cho hỗn hợp vào bỡnh nhựa đậy kớn ủ trong 3 ngày sau đú ộp lấy dịch chiết, lọc kỹ lấy dung dịch.
- Bảo quản dung dịch Bokashi ở 23 - 300C, trong điều kiện kị khớ.
2.5. Phương phỏp thử nghiệm tỏc dụng của dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo lờn giun
2.5.1. Phương phỏp sàng lọc nồng độ ức chế hoạt động của giun từ dịch chiết hạt keo giậu và Bokashi keo
* Quỏ trỡnh sàng lọc tiến hành qua 2 thớ nghiệm:
Thớ nghiệm 1. Thớ nghiệm được bố trớ trờn cỏc đĩa petri chứa 20ml dung dịch Bokashi keo hoặc dịch chiết hạt keo với cỏc nồng độ pha loóng dần. Nồng độ cao nhất bắt đầu bố trớ thớ nghiệm là 100.000ppm. Thang nồng độ
giảm 10 lần ở cỏc nghiệm thức tiếp theo. Mỗi thang nồng độ được bố trớ trờn 3 đĩa petrri (3 lần lặp lại). Nghiệm thức đối chứng là nghiệm thức khụng chứa thuốc. Cắt đoạn ruột cú chứa giun ngõm vào dung dịch với cỏc nồng độ pha sẵn. Theo dừi tỷ lệ bất hoạt của giun sau 4 giờ. Xỏc định nồng độ ức chế giun thấp nhất để bố trớ thớ nghiệm tiếp theo.
Thớ nghiệm 2. Bố trớ thớ nghiệm như cỏc thớ nghiệm ở giai đoạn 1. Một loạt nghiệm thức với cỏc nồng độ giảm dần, với nồng độ dựng cho thớ nghiệm này là nồng độ đó được xỏc định từ thớ nghiệm 1. Tuy nhiờn thang nồng độ pha loóng ở giai đoạn này là 2 lần. Mỗi thang nồng độ được lặp lại 3 lần. Lụ đối chứng là lụ chỉ chứa nước muối sinh lý mà khụng bổ sung thảo dược. Theo dừi thời gian giun ngừng hoạt động sau 4 giờ để xỏc định nồng độ ức chế giun của hạt keo để bố trớ thớ nghiệm khả năng diệt giun trũn của cỏc loại thuốc trong cỏc khoảng thời gian khỏc nhau.
2.5.2. Phương phỏp thử nghiệm nồng độ tiờu diệt giun của dịch chiết hạtkeo và Bokashi keo keo và Bokashi keo
Thớ nghiệm được bố trớ trờn cỏc đĩa Petri chứa 20ml dung dịch Bokashi keo hoặc dịch chiết hạt keo với cỏc thang nồng độ tăng hai lần. Mỗi thang nồng độ được lặp lại 3 lần. Nồng độ thấp nhất được sử dụng trong thớ nghiệm này là nồng độ thấp nhất đó được xỏc định ở thớ nghiệm 2. Theo dừi số lượng giun chết trong 30 phỳt, 1 giờ, 2 giờ và 4 giờ để xỏc định nồng độ tiờu diệt giun thấp nhất của hạt keo. Nghiệm thức khụng bổ sung thuốc là nghiệm thức đối chứng.
2.6. Phương phỏp thử tớnh độc của dịch chiết hạt keo và Bokashi keo lờn cỏ
Áp dụng phương phỏp của Reed và Muench.
* Phương phỏp bố trớ thớ nghiệm: Thớ nghiệm được bố trớ trờn 6 nghiệm thức, với nồng độ giảm dần từ 10-1 (100.000ppm)đến10-6 (1ppm). Số cỏ được
bố trớ ở mỗi nghiệm thức là 6 con với kớch cỡ cỏ thớ nghiệm trung bỡnh là 100g/con. Xỏc định LD50 của dịch chiết hạt keo và Bokashi keo (Nguyễn Ngọc Phước, 2007).
2.7. Phương phỏp xử lý số liệu
2.7.1. Tớnh cường độ và tỷ lệ cảm nhiễm
- Cường độ cảm nhiễm: Đếm toàn bộ số lượng giun ký sinh trờn cỏ
- Tỷ lệ nhiễm:
Trong đú: A1 là số cỏ bị nhiễm giun. A là số cỏ kiểm tra.
2.7.2. Xỏc định LD50
- Để xỏc định LD50 ta sử dụng cụng thức sau: (Nguyễn Ngọc Phước 2007). LD50 = 10(a + x) .
Trong đú:
10a là nồng độ mà tại đú số lượng cỏ cũn sống và số lượng cỏ chết sau thớ nghiệm đạt cõn bằng (50%).
Ta cú thể tớnh được x dựa vào cụng thức: x = (Pa - 50)/(Pa - Pu).
Với Pa là tỉ lệ cận trờn, Pu là tỉ lệ cận dưới của nồng độ gõy chết 50%. Cường độ nhiễm trung bỡnh = Tổng số giun trờn cỏc cỏ thể kiểm tra
Số cỏ thể kiểm tra
Tỷ lệ nhiễm (%) =
A1 A
2.7.3. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý trờn phần mềm Microsoft Excel 2003.
2.8. Địa điểm và thời gian nghiờn cứu
2.8.1.Địa điểm nghiờn cứu
- Địa điểm thu mẫu cỏ: Cỏ tra (Pangasius hypophthalmus), cỏ lúc (channa striata) nuụi tại Thừa Thiờn Huế.
- Địa điểm phõn tớch mẫu: Phũng thớ nghiệm Khoa Thủy sản - Trường Đại học Nụng Lõm Huế.
2.8.2. Thời gian nghiờn cứu
SƠ ĐỒ NGHIấN CỨU TỔNG THỂ
Hỡnh 2.1. Quy trỡnh sản xuất Bokashi hạt keo và dịch chiết hạt keo Bokashi hạt keo
Hạt keo
Sản phẩm
Hạt keo sau khi búc vỏ Xay nhuyễn
Vắt kiệt Lọc 300 àm
Hỡnh 2.2. Thớ nghiệm thử nghiệm tỏc dụng của dịch chiết và Bokashi hạt keo
38
Bố trớ thớ nghiệm Giải phẫu cỏ Cỏ lúc
Quan sỏt dưới kớnh hiển vi Đếm số lượng giun chết
Hỡnh 2.3. Thớ nghiệm thử nghiệm độ độc của dịch chiết và Bokashi hạt keo 39 Bố trớ thớ nghiệm Cỏ tra nuụi Bố trớ thớ nghiệm độ độc Dụng cụ thớ nghiệm
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xỏc định cơ quan cảm nhiễm của giun trờn cỏc loài cỏ nước ngọt
Cỏ khi được đưa về phũng thớ nghiệm, tiến hành cõn khối lượng và đo chiều dài bằng dụng cụ chuyờn dụng. Sau đú, tiến hành giải phẫu cỏ, lấy ruột và quan sỏt xỏc định vị trớ ký sinh của giun đầu múc. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Vị trớ ký sinh, cường độ cảm nhiễm và tỷ lệ cảm nhiễm giun đầu múc
Loài cỏ tra (con)Số kiểm nhiễm giunSố cỏ (con) Cường độ nhiễm TB (giun/cỏ) Tỷ lệ nhiễm (%) Vị trớ kýsinh Cỏ Tra (200-300g) 30 27 30 90 Ruột trước Cỏ lúc (200-300g) 30 30 43 100 Ruột trước
Kết quả thu được cho thấy, tỷ lệ nhiễm giun đầu múc trờn cỏ nước ngọt là rất cao: 100% cỏ lúc kiểm tra đều bị cảm nhiễm giun đầu múc, và 27/30 cỏ tra kiểm tra phỏt hiện thấy giun đầu múc ký sinh. Đõy là một tỷ lệ rất lớn, nú cho thấy rằng, gần như toàn bộ cỏc cỏ thể của hai loài cỏ nước ngọt này đều đó nhiễm giun đầu múc.
Bờn cạnh tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm cũng đó được tiến hành nghiờn cứu. Từ kết quả thu được cho thấy, cường độ nhiễm giun đầu múc trung bỡnh trờn cỏ lúc là 43 giun/cỏ và trờn cỏ tra là 30 giun/cỏ. Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm giun trờn hai loài cỏ này như vậy là cao. Sở dĩ cú kết quả này là vỡ đõy là hai loài ăn tạp, chỳng cú thể ăn động vật, mựn bó hữu cơ, . . . nờn cơ hội nhiễm giun từ thức ăn rất cao (Đỗ Thị Hũa, 2004).
Về vị trớ ký sinh, giun đầu múc thường ký sinh chủ yếu ở đoạn ruột trước của hệ tiờu hoỏ, hỳt chất dinh dưỡng của vật chủ, gõy tổn thương cho đoạn ruột này, tạo điều kiện cho cỏc tỏc nhõn cơ hội dễ dàng xõm nhập và gõy bệnh cho cỏ.
Như vậy, giun đầu múc là một đối tượng ký sinh chủ yếu trờn cỏ nước ngọt. Sau khi xỏc định được vị trớ ký sinh của giun đầu múc trong ruột cỏ, chỳng tụi đó tiến hành cắt đoạn ruột này làm cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
3.2. Kết quả thử nghiệm tỏc dụng của dịch chiết hạt keo với cỏc loại dung mụi
Sau khi chiết xuất hạt keo với cỏc dung mụi nước, Ethanol với cỏc nồng độ khỏc nhau và ủ Bokashi hạt keo, để xỏc định tỏc dụng của cỏc dịch chiết đú lờn giun đầu múc tụi đó tiến hành làm cỏc thớ nghiệm thử nghiệm theo dừi xỏc định thời gian giun bị bất hoạt sau 30 phỳt, 1 giờ, 2 giờ. Quan sỏt và ghi chộp kết quả nghiờn cứu thu được cú trờn bảng 3.2.
Kết quả thể hiện ở bảng 3.2 cho thấy, cỏc dịch chiết và Bokashi ở cỏc nồng độ 1ppt; 1,5ppt; 2ppt đều cú khả năng làm bất hoạt giun sau 2 giờ (100% số giun thớ nghiệm).
Dung dịch II, III, V ở nồng độ 1ppt đều cú khả năng bất hoạt giun trong 30 phỳt đầu. Tuy nhiờn khả năng này của dung dịch III, V tốt hơn, cú khả năng bất hoạt được số lượng giun lớn hơn (≥ 30 %), trong khi đú dung dịch II chỉ cú tỏc dụng làm chết 17 % số giun thớ nghiệm.
Dung dịch I và IV tuy cú khả năng làm bất hoạt giun sau 2 giờ theo dừi nhưng trong 30 phỳt đầu lại khụng cú khả năng này (0% số giun thớ nghiệm).
Như vậy ta cú thể nhận thấy dung dịch III và V là cú tỏc dụng tốt nhất ở thớ nghiệm này. Từ kết quả đú dung dịch III, V được sử dụng để thử nghiệm cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm tỏc dụng của dịch chiết hạt keo với cỏc dung mụi
Dung mụi Nồng độ(ppt) Số giun/đĩa Tỷ lệ giun chết (%)
30 phỳt 1 giờ 2 giờ Ethanol 50 (Dịch chiết I) 1 10 0 40 100 1,5 10 53 100 2 20 70 100 Ethanol 250 (Dịch chiết II) 1 10 17 60 100 1,5 33 83 100 2 50 97 100 Ethanol 450 (Dịch chiết III) 1 10 30 80 100 1,5 33 80 100 2 57 97 100 Nước (Dịch chiết IV) 1 10 0 20 100 1,5 13 60 100 2 20 63 100 EM (Bokashi V) 1 10 33 80 100 1,5 37 87 100 2 60 97 100
3.3. Kết quả sàng lọc nồng độ ức chế giun của dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo
Khi đó xỏc định được vị trớ nhiễm giun của cỏc loài cỏ, ta tiến hành cắt đoạn ruột cú chứa giun cho vào cỏc đĩa Petri đó bố trớ sẵn dịch chiết và Bokashi đó được xỏc định ở thớ nghiệm trờn với cỏc nồng độ khỏc nhau. Xỏc định tỷ lệ giun bị ức chế sau 4 giờ. Kết quả nghiờn cứu được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc nồng độ giai đoạn 1
Nồng độ (ppm) Số giun/Đĩa Khả năng tồn tại của giun sau 4 giờ
III 100.000 10 – 10.000 – 1.000 – 100 – 10 – 0 + V 100.000 10 – 10.000 – 1.000 – 100 – 10 – 0 +
Trong đú: ( – ): Giun chết hoàn toàn. ( + ): Giun cũn sống
Khụng cú sự khỏc nhau về khả năng ức chế giun của Bokashi keo và dịch chiết hạt keo (p>0,05) (Bảng 3.3). Ở nồng độ 10ppm dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo đều cú khả năng làm bất hoạt giun sau 4 giờ. Ở nghiệm thức đối chứng khụng bổ sung thuốc, sau 4 giờ quan sỏt giun vẫn cũn hoạt động bỡnh thường.
Bờn cạnh đú, ở nồng độ càng cao, khả năng ức chế hoạt động của giun càng lớn. Với nồng độ lớn hơn 1000ppm giun chết rất nhanh.
Để xỏc định nồng độ cú khả năng ức chế hoạt động của giun thấp nhất, nồng độ thấp nhất của Bokashi keo (10ppm) và dịch chiết hạt keo (10ppm) cú
khả năng bất hoạt giun đầu múc ở thớ nghiệm trờn, sẽ tiếp tục được pha loóng dần (hai lần). Kết quả sàng lọc nồng độ lần thứ hai được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc nồng độ giai đoạn 2
Nồng độ (ppm) Số giun /Đĩa Khả năng tồn tại của giun sau 4 giờ
III 10 10 – 5 – 2,5 + 0 + V 10 10 – 5 – 2,5 – 1,25 + 0 +
Trong đú: ( – ): Giun chết hoàn toàn. ( + ): Giun cũn sống.
Ở nồng độ 2,5ppm Bokashi keo cú khả năng ức chế hoàn toàn hoạt động của giun ký sinh trờn cỏ. Ở nồng độ thấp hơn (1,25ppm) Bokashi keo khụng cũn khả năng ức chế giun. Trong khi đú, dịch chiết hạt keo cú thể kỡm hóm hoạt động sống của giun đầu múc ở nồng độ từ 5ppm trở lờn. Nghiệm thức đối