2.4.3.1. Phương phỏp sản xuất EM thứ cấp * Nguyờn liệu: - Nước 7 ( Lớt) - Rỉ đường 0,5l - Dấm 0,5l - Cồn 1L - EM1 1L
Nước phải sạch, là nước ngầm hoặc nước mỏy đó khử hết Clo. Dấm tự nhiờn tốt hơn dấm húa học.
Cồn (C2H5OH): 400 - 450.
* Phương phỏp pha chế
- Trộn rỉ đường với nước trước để hũa tan hết rỉ đường. - Đổ dấm, cồn vào theo đỳng tỉ lệ, chỳ ý lắc cho thật đều.
- Đổ EM1 vào hỗn hợp và lắc đều. Đậy nắp kớn, ủ trong can nhựa và duy trỡ ở điều kiện kỵ khớ.
Chỳ ý: Khi pha chế thỡ EM1 luụn luụn phải pha sau cựng để trỏnh sự tiờu diệt cỏc vi khuẩn cú lợi. EM thứ cấp cú mựi thơm ngọt của hoa quả là cú chất lượng tốt. Duy trỡ ổn định nhiệt độ, EM được sử dụng sau 3 ngày và cú thể dựng được trong vũng 3 thỏng.
2.4.3.2. Phương phỏp tỏch chiết hoạt chất từ hạt keo và sản xuất Bokashi keo * Phương phỏp tỏch chiết hoạt chất từ hạt keo
- Keo tươi tỏch lấy hạt, cõn trọng lượng và ngõm với dung mụi (nước cất hoặc Ethanol) với tỷ lệ 1: 2 rồi cho vào mỏy xay xay thật nhuyễn.
- Để hỗn hợp hạt keo và dung mụi trong điều kiện kỵ khớ, ở nhiệt độ 25 - 300. 3 ngày sau đú vắt lấy dịch chiết, lọc qua lưới lọc.
- Bảo quản ở nhiệt độ 25 - 300C, trong điều kiện kỵ khớ.
* Phương phỏp sản xuất Bokashi keo
- Hạt keo tươi được trộn với EM thứ cấp theo tỉ lệ 1:2 rồi xay nhuyễn. - Cho hỗn hợp vào bỡnh nhựa đậy kớn ủ trong 3 ngày sau đú ộp lấy dịch chiết, lọc kỹ lấy dung dịch.
- Bảo quản dung dịch Bokashi ở 23 - 300C, trong điều kiện kị khớ.
2.5. Phương phỏp thử nghiệm tỏc dụng của dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo lờn giun
2.5.1. Phương phỏp sàng lọc nồng độ ức chế hoạt động của giun từ dịch chiết hạt keo giậu và Bokashi keo
* Quỏ trỡnh sàng lọc tiến hành qua 2 thớ nghiệm:
Thớ nghiệm 1. Thớ nghiệm được bố trớ trờn cỏc đĩa petri chứa 20ml dung dịch Bokashi keo hoặc dịch chiết hạt keo với cỏc nồng độ pha loóng dần. Nồng độ cao nhất bắt đầu bố trớ thớ nghiệm là 100.000ppm. Thang nồng độ
giảm 10 lần ở cỏc nghiệm thức tiếp theo. Mỗi thang nồng độ được bố trớ trờn 3 đĩa petrri (3 lần lặp lại). Nghiệm thức đối chứng là nghiệm thức khụng chứa thuốc. Cắt đoạn ruột cú chứa giun ngõm vào dung dịch với cỏc nồng độ pha sẵn. Theo dừi tỷ lệ bất hoạt của giun sau 4 giờ. Xỏc định nồng độ ức chế giun thấp nhất để bố trớ thớ nghiệm tiếp theo.
Thớ nghiệm 2. Bố trớ thớ nghiệm như cỏc thớ nghiệm ở giai đoạn 1. Một loạt nghiệm thức với cỏc nồng độ giảm dần, với nồng độ dựng cho thớ nghiệm này là nồng độ đó được xỏc định từ thớ nghiệm 1. Tuy nhiờn thang nồng độ pha loóng ở giai đoạn này là 2 lần. Mỗi thang nồng độ được lặp lại 3 lần. Lụ đối chứng là lụ chỉ chứa nước muối sinh lý mà khụng bổ sung thảo dược. Theo dừi thời gian giun ngừng hoạt động sau 4 giờ để xỏc định nồng độ ức chế giun của hạt keo để bố trớ thớ nghiệm khả năng diệt giun trũn của cỏc loại thuốc trong cỏc khoảng thời gian khỏc nhau.
2.5.2. Phương phỏp thử nghiệm nồng độ tiờu diệt giun của dịch chiết hạtkeo và Bokashi keo keo và Bokashi keo
Thớ nghiệm được bố trớ trờn cỏc đĩa Petri chứa 20ml dung dịch Bokashi keo hoặc dịch chiết hạt keo với cỏc thang nồng độ tăng hai lần. Mỗi thang nồng độ được lặp lại 3 lần. Nồng độ thấp nhất được sử dụng trong thớ nghiệm này là nồng độ thấp nhất đó được xỏc định ở thớ nghiệm 2. Theo dừi số lượng giun chết trong 30 phỳt, 1 giờ, 2 giờ và 4 giờ để xỏc định nồng độ tiờu diệt giun thấp nhất của hạt keo. Nghiệm thức khụng bổ sung thuốc là nghiệm thức đối chứng.
2.6. Phương phỏp thử tớnh độc của dịch chiết hạt keo và Bokashi keo lờn cỏ
Áp dụng phương phỏp của Reed và Muench.
* Phương phỏp bố trớ thớ nghiệm: Thớ nghiệm được bố trớ trờn 6 nghiệm thức, với nồng độ giảm dần từ 10-1 (100.000ppm)đến10-6 (1ppm). Số cỏ được
bố trớ ở mỗi nghiệm thức là 6 con với kớch cỡ cỏ thớ nghiệm trung bỡnh là 100g/con. Xỏc định LD50 của dịch chiết hạt keo và Bokashi keo (Nguyễn Ngọc Phước, 2007).
2.7. Phương phỏp xử lý số liệu
2.7.1. Tớnh cường độ và tỷ lệ cảm nhiễm
- Cường độ cảm nhiễm: Đếm toàn bộ số lượng giun ký sinh trờn cỏ
- Tỷ lệ nhiễm:
Trong đú: A1 là số cỏ bị nhiễm giun. A là số cỏ kiểm tra. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.7.2. Xỏc định LD50
- Để xỏc định LD50 ta sử dụng cụng thức sau: (Nguyễn Ngọc Phước 2007). LD50 = 10(a + x) .
Trong đú:
10a là nồng độ mà tại đú số lượng cỏ cũn sống và số lượng cỏ chết sau thớ nghiệm đạt cõn bằng (50%).
Ta cú thể tớnh được x dựa vào cụng thức: x = (Pa - 50)/(Pa - Pu).
Với Pa là tỉ lệ cận trờn, Pu là tỉ lệ cận dưới của nồng độ gõy chết 50%. Cường độ nhiễm trung bỡnh = Tổng số giun trờn cỏc cỏ thể kiểm tra
Số cỏ thể kiểm tra
Tỷ lệ nhiễm (%) =
A1 A
2.7.3. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý trờn phần mềm Microsoft Excel 2003.
2.8. Địa điểm và thời gian nghiờn cứu
2.8.1.Địa điểm nghiờn cứu
- Địa điểm thu mẫu cỏ: Cỏ tra (Pangasius hypophthalmus), cỏ lúc (channa striata) nuụi tại Thừa Thiờn Huế.
- Địa điểm phõn tớch mẫu: Phũng thớ nghiệm Khoa Thủy sản - Trường Đại học Nụng Lõm Huế.
2.8.2. Thời gian nghiờn cứu
SƠ ĐỒ NGHIấN CỨU TỔNG THỂ
Hỡnh 2.1. Quy trỡnh sản xuất Bokashi hạt keo và dịch chiết hạt keo Bokashi hạt keo
Hạt keo
Sản phẩm
Hạt keo sau khi búc vỏ Xay nhuyễn
Vắt kiệt Lọc 300 àm
Hỡnh 2.2. Thớ nghiệm thử nghiệm tỏc dụng của dịch chiết và Bokashi hạt keo
38
Bố trớ thớ nghiệm Giải phẫu cỏ Cỏ lúc
Quan sỏt dưới kớnh hiển vi Đếm số lượng giun chết
Hỡnh 2.3. Thớ nghiệm thử nghiệm độ độc của dịch chiết và Bokashi hạt keo 39 Bố trớ thớ nghiệm Cỏ tra nuụi Bố trớ thớ nghiệm độ độc Dụng cụ thớ nghiệm
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xỏc định cơ quan cảm nhiễm của giun trờn cỏc loài cỏ nước ngọt
Cỏ khi được đưa về phũng thớ nghiệm, tiến hành cõn khối lượng và đo chiều dài bằng dụng cụ chuyờn dụng. Sau đú, tiến hành giải phẫu cỏ, lấy ruột và quan sỏt xỏc định vị trớ ký sinh của giun đầu múc. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1. Vị trớ ký sinh, cường độ cảm nhiễm và tỷ lệ cảm nhiễm giun đầu múc
Loài cỏ tra (con)Số kiểm nhiễm giunSố cỏ (con) Cường độ nhiễm TB (giun/cỏ) Tỷ lệ nhiễm (%) Vị trớ kýsinh Cỏ Tra (200-300g) 30 27 30 90 Ruột trước Cỏ lúc (200-300g) 30 30 43 100 Ruột trước
Kết quả thu được cho thấy, tỷ lệ nhiễm giun đầu múc trờn cỏ nước ngọt là rất cao: 100% cỏ lúc kiểm tra đều bị cảm nhiễm giun đầu múc, và 27/30 cỏ tra kiểm tra phỏt hiện thấy giun đầu múc ký sinh. Đõy là một tỷ lệ rất lớn, nú cho thấy rằng, gần như toàn bộ cỏc cỏ thể của hai loài cỏ nước ngọt này đều đó nhiễm giun đầu múc.
Bờn cạnh tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm cũng đó được tiến hành nghiờn cứu. Từ kết quả thu được cho thấy, cường độ nhiễm giun đầu múc trung bỡnh trờn cỏ lúc là 43 giun/cỏ và trờn cỏ tra là 30 giun/cỏ. Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm giun trờn hai loài cỏ này như vậy là cao. Sở dĩ cú kết quả này là vỡ đõy là hai loài ăn tạp, chỳng cú thể ăn động vật, mựn bó hữu cơ, . . . nờn cơ hội nhiễm giun từ thức ăn rất cao (Đỗ Thị Hũa, 2004).
Về vị trớ ký sinh, giun đầu múc thường ký sinh chủ yếu ở đoạn ruột trước của hệ tiờu hoỏ, hỳt chất dinh dưỡng của vật chủ, gõy tổn thương cho đoạn ruột này, tạo điều kiện cho cỏc tỏc nhõn cơ hội dễ dàng xõm nhập và gõy bệnh cho cỏ.
Như vậy, giun đầu múc là một đối tượng ký sinh chủ yếu trờn cỏ nước ngọt. Sau khi xỏc định được vị trớ ký sinh của giun đầu múc trong ruột cỏ, chỳng tụi đó tiến hành cắt đoạn ruột này làm cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
3.2. Kết quả thử nghiệm tỏc dụng của dịch chiết hạt keo với cỏc loại dung mụi
Sau khi chiết xuất hạt keo với cỏc dung mụi nước, Ethanol với cỏc nồng độ khỏc nhau và ủ Bokashi hạt keo, để xỏc định tỏc dụng của cỏc dịch chiết đú lờn giun đầu múc tụi đó tiến hành làm cỏc thớ nghiệm thử nghiệm theo dừi xỏc định thời gian giun bị bất hoạt sau 30 phỳt, 1 giờ, 2 giờ. Quan sỏt và ghi chộp kết quả nghiờn cứu thu được cú trờn bảng 3.2.
Kết quả thể hiện ở bảng 3.2 cho thấy, cỏc dịch chiết và Bokashi ở cỏc nồng độ 1ppt; 1,5ppt; 2ppt đều cú khả năng làm bất hoạt giun sau 2 giờ (100% số giun thớ nghiệm).
Dung dịch II, III, V ở nồng độ 1ppt đều cú khả năng bất hoạt giun trong 30 phỳt đầu. Tuy nhiờn khả năng này của dung dịch III, V tốt hơn, cú khả năng bất hoạt được số lượng giun lớn hơn (≥ 30 %), trong khi đú dung dịch II chỉ cú tỏc dụng làm chết 17 % số giun thớ nghiệm.
Dung dịch I và IV tuy cú khả năng làm bất hoạt giun sau 2 giờ theo dừi nhưng trong 30 phỳt đầu lại khụng cú khả năng này (0% số giun thớ nghiệm).
Như vậy ta cú thể nhận thấy dung dịch III và V là cú tỏc dụng tốt nhất ở thớ nghiệm này. Từ kết quả đú dung dịch III, V được sử dụng để thử nghiệm cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm tỏc dụng của dịch chiết hạt keo với cỏc dung mụi
Dung mụi Nồng độ(ppt) Số giun/đĩa Tỷ lệ giun chết (%)
30 phỳt 1 giờ 2 giờ Ethanol 50 (Dịch chiết I) 1 10 0 40 100 1,5 10 53 100 2 20 70 100 Ethanol 250 (Dịch chiết II) 1 10 17 60 100 1,5 33 83 100 2 50 97 100 Ethanol 450 (Dịch chiết III) 1 10 30 80 100 1,5 33 80 100 2 57 97 100 Nước (Dịch chiết IV) 1 10 0 20 100 1,5 13 60 100 2 20 63 100 EM (Bokashi V) 1 10 33 80 100 1,5 37 87 100 2 60 97 100
3.3. Kết quả sàng lọc nồng độ ức chế giun của dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo
Khi đó xỏc định được vị trớ nhiễm giun của cỏc loài cỏ, ta tiến hành cắt đoạn ruột cú chứa giun cho vào cỏc đĩa Petri đó bố trớ sẵn dịch chiết và Bokashi đó được xỏc định ở thớ nghiệm trờn với cỏc nồng độ khỏc nhau. Xỏc định tỷ lệ giun bị ức chế sau 4 giờ. Kết quả nghiờn cứu được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc nồng độ giai đoạn 1
Nồng độ (ppm) Số giun/Đĩa Khả năng tồn tại của giun sau 4 giờ
III 100.000 10 – 10.000 – 1.000 – 100 – 10 – 0 + V 100.000 10 – 10.000 – 1.000 – 100 – 10 – 0 +
Trong đú: ( – ): Giun chết hoàn toàn. ( + ): Giun cũn sống
Khụng cú sự khỏc nhau về khả năng ức chế giun của Bokashi keo và dịch chiết hạt keo (p>0,05) (Bảng 3.3). Ở nồng độ 10ppm dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo đều cú khả năng làm bất hoạt giun sau 4 giờ. Ở nghiệm thức đối chứng khụng bổ sung thuốc, sau 4 giờ quan sỏt giun vẫn cũn hoạt động bỡnh thường.
Bờn cạnh đú, ở nồng độ càng cao, khả năng ức chế hoạt động của giun càng lớn. Với nồng độ lớn hơn 1000ppm giun chết rất nhanh.
Để xỏc định nồng độ cú khả năng ức chế hoạt động của giun thấp nhất, nồng độ thấp nhất của Bokashi keo (10ppm) và dịch chiết hạt keo (10ppm) cú
khả năng bất hoạt giun đầu múc ở thớ nghiệm trờn, sẽ tiếp tục được pha loóng dần (hai lần). Kết quả sàng lọc nồng độ lần thứ hai được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc nồng độ giai đoạn 2
Nồng độ (ppm) Số giun /Đĩa Khả năng tồn tại của giun sau 4 giờ
III 10 10 – 5 – 2,5 + 0 + V 10 10 – 5 – 2,5 – 1,25 + 0 +
Trong đú: ( – ): Giun chết hoàn toàn. ( + ): Giun cũn sống.
Ở nồng độ 2,5ppm Bokashi keo cú khả năng ức chế hoàn toàn hoạt động của giun ký sinh trờn cỏ. Ở nồng độ thấp hơn (1,25ppm) Bokashi keo khụng cũn khả năng ức chế giun. Trong khi đú, dịch chiết hạt keo cú thể kỡm hóm hoạt động sống của giun đầu múc ở nồng độ từ 5ppm trở lờn. Nghiệm thức đối chứng khụng bổ sung thuốc, giun vẫn hoạt động mạnh sau 4 giờ thớ nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như vậy qua hai bảng kết quả sàng lọc nồng độ thỡ Bokashi keo ở nồng độ 2,5ppm và dịch chiết hạt keo cú nồng độ 5ppm cú khả năng ức chế giun nhanh. Do đú ta cú thể bố trớ thớ nghiệm để xỏc định khả năng tiờu diệt giun ở cỏc mức nồng độ này.
3.4. Kết quả thử nghiệm nồng độ tiờu diệt giun của dịch chiết hạt keo vàBokashi hạt keo Bokashi hạt keo
Sau khi xỏc định được nồng độ cú khả năng ức chế giun thấp nhất ở thớ nghiệm trờn ta tiến hành bố trớ thớ nghiệm xỏc định nồng độ tiờu diệt giun của dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo. Kết quả thu được cú ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả xỏc định nồng độ gõy chết của dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo
Nồng độ
(ppm) Số giun/Đĩa
Tỷ lệ giun chết sau cỏc khoảng thời gian (%)
30 phỳt 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ
III 0 10 0 0 0 0 0 2,5 0 0 3 20 40 5 0 0 17 60 100 10 0 0 43 100 100 20 0 13 40 100 100 V 0 10 0 0 0 0 0 2,5 0 0 0 30 100 5 0 0 27 70 100 10 0 0 47 100 100 20 0 17 47 100 100
Thời gian giun chết ở cỏc nồng độ thớ nghiệm khỏc nhau cú sự khỏc nhau rừ rệt. Ở nồng độ 20ppm, Bokashi keo (cụng thức V) cú khả năng diệt được 17% lượng giun trong 60 phỳt. Ở cỏc nồng độ thấp hơn (5 và 10ppm), thời gian diệt hoàn toàn số giun cú trong dạ dày kộo dài hơn. Sau 120 phỳt, chỉ cú
27 - 47% số giun chết khi dựng nồng độ 5 hoặc 10ppm. Tỏc dụng diệt giun triệt để với Bokashi hạt keo chỉ sau 4 giờ khi dựng nồng độ 2,5ppm và sau 3 giờ với nồng độ 10ppm.
Tương tự như thớ nghiệm Bokashi keo, thỡ thời gian gõy chết giun của dịch chiết hạt keo (cụng thức III) ở cỏc mức nồng độ khỏc nhau thỡ cũng cú sự khỏc nhau rừ rệt, ở nồng độ 20ppm dịch chiết hạt keo cú tỏc dụng mạnh nhất và khả năng gõy chết 13% lượng giun sau 30 phỳt, thấp hơn một ớt so với Bokashi keo (17%). Trong khi đú, ở nồng độ thấp hơn thỡ tỏc dụng yếu hơn. Tỏc dụng diệt giun triệt để với dịch chiết hạt keo chỉ sau 4 giờ khi dựng nồng độ 5 ppm và sau 3 giờ với nồng độ 10ppm.
Với cỏc nồng độ khỏc nhau thời gian giun chết hoàn toàn khỏc nhau. Ở nồng độ 10ppm và 20ppm của Bokashi hạt keo và dịch chiết hạt keo cú thể tiờu diệt giun hoàn toàn sau 3 giờ. Ở nồng độ thấp hơn 2,5ppm của Bokashi hạt keo và 5ppm của dịch chiết hạt keo thời gian kộo dài hơn, cú thể tiờu diệt giun sau 4 giờ.
Từ kết quả thu được ở cỏc thớ nghiệm trờn ta cú được kết quả về cỏc nồng độ ức chế và tiờu diệt tối thiểu của dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Nồng độ ức chế và tiờu diệt tối thiểu của dịch chiết hạt keo và Bokashi hạt keo
Chế phẩm Nồng độ ức chế
tối thiểu (MIC)
Nồng độ tiờu diệt