L ỜI CẢM ƠN
2.1.6. Mụi trường pha loóng tinh dịch bũ
Nhờ pha loóng nờn ủó phỏt huy ủược tớnh ưu việt của thụ tinh nhõn tạo như tăng khả năng chịu lạnh, tăng hiệu quả sử dụng tinh dịch bũ. Mụi trường pha loóng cần ủảm bảo những tớnh chất sau ủõy:
2.1.6.1. Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của một chất lỏng phụ thuộc vào nồng ủộ hũa tan của cỏc phõn tử và cỏc ion cú trong dung dịch ủú. ðể cho tinh trựng tồn tại ủược, ỏp suất thẩm thấu của mụi trường (ỏp suất ngoại bào) phải tương ủương như ỏp suất thẩm thấu bờn trong tinh trựng (ỏp suất nội bào), tức là cú hiện tượng ủẳng trương. Cỏc dung dịch ưu trương (ỏp suất ngoại bào lớn hơn ỏp suất nội bào) sẽ
làm cho tinh trựng teo lại. Cỏc dung dịch nhược trương (ỏp suất ngoại bào thấp hơn ỏp suất nội bào) sẽ làm cho tinh trựng trương phồng lờn và cú thể gõy vỡ
màng tinh trựng (Nguyễn Tấn Anh, 1984)[1]. Tuy nhiờn trong thực tế khả năng chịu ủựng ỏp suất thẩm thấu của tinh trựng khụng chặt chẽ mà chỳng chịu ủựng và tồn tại ủược trong một khoảng giỏ trị ỏp suất thẩm thấu biến thiờn nhất ủịnh dao ủộng từ 250 ủến 500 mosmol, nhờ khả năng thớch ứng và ủộ bền thẩm thấu của màng tế bào (Innecda, 1995 trớch từ Hà Văn Chiờu, 1999[12]). Vỡ vậy nồng
ủộ của cỏc chất tan trong mụi trường pha loóng cần tạo nờn một ỏp suất thẩm thấu phự hợp với khả năng chịu ủựng của tinh trựng.
2.1.6.2. pH và năng lực ủệm của mụi trường
pH của mụi trường phụ thuộc vào nồng ủộ H+ cú trong mụi trường. Nồng
ủộ H+ càng tăng thỡ mụi trường càng toan tớnh và ngược lại. Mụi trường pha loóng tinh dịch phải cú pH 6,2-6,8 (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc ðạt, 1997)[2]. Trong sản xuất ủể mụi trường pha loóng tinh dịch cú khả năng duy trỡ một cỏch ổn ủịnh ủộ pH ở mức thớch hợp, người ta ủưa vào mụi trường loại hoỏ chất cú tỏc dụng làm giảm khả năng kiềm hoỏ hoặc toan hoỏ của mụi trường.
2.1.6.3. Chất ủiện giải và khụng ủiện giải trong mụi trường
Chất khụng ủiện giải làm giảm ủộ dẫn ủiện của mụi trường giỳp tinh trựng trỏnh ủược mất ủiện tớch, ngăn ngừa hiện tượng tụ dớnh của tinh trựng và tạo ủiều kiện thuận lợi cho tinh trựng duy trỡ sự sống. Chất khụng ủiện giải giữ vai trũ chất khử, gỏnh chịu sự tỏc ủộng của oxy nờn cú tỏc dụng như chất
chống oxy hoỏ và bảo vệ chất chống ủụng của tinh dịch khỏi bị oxy hoỏ. Tinh trựng rất mẫn cảm với dung dịch NaCl, nhưng vẫn phải ủưa vào mụi trường pha loóng tinh dịch một lượng nhất ủịnh chất ủiện giải khụng ủộc và cú anion hoỏ trị cao. Nếu tăng cation sẽ làm cho tinh trựng tụ dớnh, khi ủụng lạnh tinh trựng sẽ chúng chết, cũn cỏc anion tỏc ủộng lờn tinh trựng tốt hơn, vỡ nú chống ủược hiện tượng tụ dớnh của tinh trựng (Tsuyoshi, 1992)[57], cỏc muối cũn cú tỏc dụng chống hiện tượng trương phồng coloid của nguyờn sinh chất và màng tinh trựng, hạn chế ngộ ủộc bằng những sản phẩm toan tớnh, ủồng thời duy trỡ năng lực ủệm của mụi trường pha loóng tinh dịch.
2.1.6.4. Tỏc dụng của Glycerol
Glycerol là một chất bảo vệ cần thiết, cú tỏc dụng như một chất chống
ủúng băng cho tinh trựng (Hiroshi, 1992)[45].
a. Làm thay ủổi ủụng lạnh và giải ủụng ủối với thể vẩn tế bào
Glycerol cú ảnh hưởng ủến thể vẩn tế bào khi ủược ủụng lạnh rồi giải
ủụng. Vớ dụ nếu thể vẩn tinh trựng trong dung dịch Ringer ủược phết mỏng trờn phiến kớnh, khi ủược làm lạnh nú bắt ủầu ủụng lạnh ở 0-80C. Cỏc tinh thể băng cú hỡnh gậy dẹt, hỡnh năm cạnh, ở biờn ủộ nhiệt ủộ này nú lớn lờn nhanh chúng.
Ở nhiệt ủộ khoảng -200C, tinh trựng bị ủẩy ủi do sự lớn lờn của cỏc tinh thể băng và buộc phải vào khoảng trống giữa cỏc tinh thể băng khỏc. Làm ấm nhanh sẽ làm giảm số lượng tinh thể này và kớch thớch tăng nhanh số bọt khớ và những vết nứt trờn tinh thể băng. Khi băng tan tinh trựng nằm ở rỡa cỏc tinh thể. Tinh trựng lơ lửng trong dung dịch Ringer cú chứa 15-20% glycerol bắt
ủầu ủụng lạnh ở -100C ủến -200C. Cỏc tinh thể băng khi lớn lờn cú hỡnh giống như một chiếc lụng chim hoặc cõy dương xỉ. Thậm chớ ở -400C, với khụng gian khỏ chật giữa cỏc tinh thể, tinh trựng vẫn lơ lửng giữa những khoảng hở
này. Khi dung dịch ủược làm ấm lờn, cỏc tinh thể băng tan chảy chậm, nhưng khụng thay ủổi nhanh chúng như trước ủú. Bằng cỏch này, glycerol cú tỏc
dụng như là một chất hũa tan muối và làm giảm bớt những thay ủổi vật lý học khi làm ủụng lạnh và giải ủụng (Hiroshi, 1992)[45].
b. Glycerol ủi vào tế bào
Trong mụi trường pha loóng tinh glycerol ngấm vào tinh trựng thay thế
nước bị mất ủi làm cho tế bào tinh trựng khụng bị teo. Glycerol làm cho nước
ủụng băng ở dạng hạt nhỏ, loại trừủược sự dón nở của tinh thể nước nội bào, chống ủược sự phỏ vỡ tế bào, nú cũn giữ ủược sự ổn ủịnh nồng ủộ của cỏc chất hoà tan, khụng làm thay ủổi ỏp suất thẩm thấu, hạn chế việc phỏ vỡ cỏc protein của tinh trựng (Hiroshi, 1992)[45].
2.1.6.5. Tỏc dụng của khỏng sinh trong mụi trường pha loóng
Trong mụi trường pha loóng tinh dịch thường cú một lượng khỏng sinh nhất ủịnh, thường là Peniciline và Streptomycine. Peniciline cú tỏc dụng
ức chế tổng hợp cỏc mucopeptid của vỏ tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn trưởng thành, vỏ tế bào mỏng ra tại một số ủiểm ủể chuẩn bị phõn bào, tại cỏc ủiểm ủú peniciline phong bế men chuyển húa peptit, làm cho vỏ tế bào vi khuẩn khụng
ủược bổ sung, trong lỳc thể tớch của nguyờn sinh chất vẫn tăng làm tế bào vi khuẩn vỡ (Hoàng Tớch Huyền, 1994)[20].Vỏ tế bào vi khuẩn gram dương chứa 60% mucopeptit, nờn chịu tỏc ủộng và phõn hủy theo cơ chế của peniciline, cỏc vi khuẩn gram õm chỉ cú 10% mucopeptit, nờn khụng mẫn cảm với penicilin. Steptomycine làm tổn hại ủến ARN thụng tin, làm cho ARN thụng tin chọn nhầm cỏc axớt amin, tạo ra một ủa peptit khỏc, protein ủặc trưng khụng hỡnh thành do ủú vi khuẩn mới khụng ủược tạo nờn (Hoàng Tớch Huyền, 1994)[20].
2.2. Những nghiờn cứu trong và ngoài nước về số lượng, chất lượng và khả năng sản xuất tinh của bũ ủực Zờbu (Bos indicus)
Bajwa (1986)[35] nghiờn cứu trờn bũ Zờbu cho biết nồng ủộ tinh trựng trung bỡnh dao ủộng 0,8 tỷ/ml ủến 1,2 tỷ/ml; hoạt lực tinh trựng dao ủộng 67%
Nghiờn cứu trờn bũ Brahman nuụi tại Florida Mỹ, Michael và CS (1982)[54] cho biết, hoạt lực tinh trựng trung bỡnh của bũ Brahman là 47,0% và thể tớch tinh dịch là 5,3 ml.
Leon và CS (1991)[50] nghiờn cứu trờn 30 bũ ủực nõu Thụy Sỹ và 30 bũ ủực Zờbu cho biết kết quả trờn bũ Zờbu: thể tớch tinh dịch trung bỡnh là 6,4ml; pH=6,96 và nồng ủộ tinh trựng là 1,05 tỷ/ml.
Risco và CS (1993)[55] nghiờn cứu trờn bũ Brahman ở Floria Mỹ
cho biết hoạt lực tinh trựng trung bỡnh của bũ Brahman là 66,0 % và tỷ lệ tinh trựng sống là 83,01%.
Brito và CS (2002)[36] nghiờn cứu trờn 68 bũ Bos indicus cho biết nồng ủộ tinh trựng 1,5 tỷ/ml và hoạt lực tinh trựng 59,3%;
Brito và CS (2002)[37] nghiờn cứu ở 7 bũ ủực giống Bos indicus tại Brazil cho biết ở bũ Bos indicus: thể tớch tinh dịch ủạt 6,6ml và hoạt lực tinh trựng ủạt 59%.
Brito và CS (2004)[38] nghiờn cứu trờn bũ Bos indicus cho biết kỳ hỡnh trung bỡnh là 15,9 %.
Tatman và CS (2004) [56], nghiờn cứu trờn bũ ủực Brahman ở Mỹ cho biết hoạt lực tinh trựng trung bỡnh là 60,0%.
Anwar và CS (2008)[31] nghiờn cứu ảnh hưởng nhiệt ủộ giải ủụng ủến hoạt lực tinh trựng sau giải ủụng trờn bũ Zờbu cho biết: giải ủụng ở nhiệt ủộ
370C cho kết quả hoạt lực sau giải ủụng ủạt cao nhất, trung bỡnh là 46,7%. Herliantien (2009)[44] cho biết thể tớch tinh dịch bũ ủực từ 2-14ml; pH tinh dịch từ 6,2-6,8 và khả năng sản xuất tinh bũ ủụng lạnh của bũ Brahman tại Trung tõm thụ tinh nhõn tạo Singosari ở Indonesia trung bỡnh ủạt 14.350 cọng rạ/con/năm.
Nghiờn cứu khả năng sản xuất tinh của bũ Zờbu ở Việt Nam, một số tỏc giảủó nghiờn cứu cho biết:
Hà Văn Chiờu (1999)[12] nghiờn cứu một số ủặc ủiểm sinh học tinh dịch bũ HF, Zờbu và khả Năng sản xuất tinh ủụng lạnh của chỳng tại Việt Nam cho kết quả: ở bũ Zờbu, thể tớch tinh dịch là 4,25ml/lần; nồng ủộ tinh trựng là 0,94tỷ/ml; hoạt lực tinh trựng là 58,76%; pH là 6,6; tỷ lệ tinh trựng kỳ hỡnh là 18,45% và tỷ lệ tinh trựng sống là 79,1%.
Lờ Bỏ Quế và CS (2001) [23] nghiờn cứu trờn bũ Zờbu (Bos Indicus)
cho biết ảnh hưởng của chế ủộ dinh dưỡng ủến từng ủặc ủiểm sinh học của tinh dịch là khụng ủỏng kể nhưng sự ảnh hưởng tổng hợp của chỳng ủến khả
năng sản xuất tinh ủụng lạnh là rất lớn và cho kết quả: nồng ủộ tinh trựng là 0,91 tỷ/ml; pH là 6,4-6,8; tỵ lệ tinh trựng kỳ hỡnh 18% và khả năng sản xuất tinh viờn trung bỡnh 3.414 viờn/con/năm (cao nhất ủạt 6.439 viờn/con/năm)
Nguyễn Xuõn Trạch và CS (2006)[29] cho biết ở cỏc nước ụn ủới chất lượng tinh dịch kộm nhất vào mựa ủụng, tốt nhất vào mựa hố và mựa thu. Nhưng
ở nước ta tinh dịch thường kộm nhất vào mựa hố do quỏ nắng núng; tinh dịch tốt nhất là vụủụng xuõn.
3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.1. ðối tượng, ủịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu
3.1.1. ðối tượng nghiờn cứu
Tinh dịch của 10 bũ ủực giống Brahman, trong ủú:
+ 4 bũ cú nguồn gốc Cuba sinh tại Việt Nam (gọi tắt là Brahman CuBa). + 6 bũ nhập từ Australia (gọi tắt là Brahman Australia).
Bũ ủực giống trong nghiờn cứu cú khối lượng cơ thể từ 718 kg ủến 844 kg, ủược chọn lọc kỹ theo từng cỏ thể thụng qua lý lịch 3 ủời (ụng bà, bố mẹ
và bản thõn). Bố mẹ là bũ Brahman thuần chủng, ủạt ủặc cấp kỷ lục.
Bũ cú ngoại hỡnh, sinh trưởng, phỏt triển tốt, ủạt ủặc cấp kỷ lục ủược cỏc cơ quan quản lý giống của Bộ Nụng nghiệp và PTNT phờ duyệt là bũ ủực giống quốc gia 2008-2009 (Cục chăn nuụi, 2008)[13].
Bũ cú lý lịch rừ ràng, khả năng sinh trưởng phỏt triển tốt, khụng bệnh tật, khả năng tăng khối lượng cao từ 830g ủến 880g/ngày; tỷ lệ thịt xẻ từ 53,5% ủến 54,7%; ủược khai thỏc tinh ủể sản xuất tinh ủụng lạnh dạng cọng rạ phục vụ cho cụng tỏc cải tiến, nõng cao chất lượng giống bũ thịt Việt Nam (Nguyễn Văn Thiện và CS, 2008) [26].
3.1.2. ðịa ủiểm và ủiều kiện nghiờn cứu
ðịa ủiểm: số bũ ủực giống trờn ủược nuụi dưỡng tại Trạm nghiờn cứu và sản xuất tinh ủụng lạnh Mụncaủa (Xó Tản Lĩnh- Ba Vỡ - Hà Nội), cỏch trung tõm Hà Nội về phớa tõy - bắc khoảng 60 km với toạủộủịa lý: 21007’26”
ủộ vĩ bắc, 105022’00”ủộ kinh ủụng.
ðiều kiện khớ hậu ủịa bàn
- Nhiệt ủộ khụng khớ (Phụ lục 5 ở bảng 5.1) + Nhiệt ủộ trung bỡnh cả năm: 23,38 oC.
+ Nhiệt ủộ tối ủa tuyệt ủối: 39,4 oC (thỏng 6) + Nhiệt ủộ tối thấp tuyệt ủối: 5,2 oC (thỏng 1) - ðộẩm khụng khớ (Phụ lục 5 ở bảng 5.2) + ðộẩm trung bỡnh: 84% (cả năm) + ðộẩm tối ủa 90 % (thỏng 1; 2 và 3) + ðộẩm tối thấp 27 % (thỏng 1) - Lượng mưa trong năm (Phụ lục 5 ở bảng 5.3) + Lượng mưa trung bỡnh: 171,92mm + Lượng mưa tối ủa: Thỏng 7 và thỏng 8 + Lượng mưa thấp: Thỏng 12, 1; 2; 3. - Giờ chiếu sỏng: (Phụ lục 5 bảng 5.4) + Giờ chiếu sỏng trung bỡnh: 41,83 giờ/thỏng + Giờ chiếu sỏng tối ủa: 60 giờ/thỏng (thỏng 7, thỏng 9) + Giờ chiếu sỏng tối thiểu 16 giờ/thỏng (thỏng 2) ðiều kiện nghiờn cứu
- Tất cả bũ ủực giống ủược chăm súc, nuụi dưỡng theo cựng quy trỡnh kỹ thuật ủỏp ứng ủầy ủủ tiờu chớ theo quyết ủịnh 66/2005/Qð-BNN của Bộ
Nụng nghiệp và PTNT (Bộ Nụng nghiệp và PTNT, 2005)[6]; mỗi cỏ thểủược nuụi trong một ụ chuồng riờng diện tớch là 45m2, trong ủú: 20m2 cú mỏi che và 25m2 sõn chơi khụng mỏi; cú mỏng ăn và mỏng uống riờng cho từng con. Hàng ngày, chuồng trại, mỏng ăn, uống ủược vệ sinh sạch sẽ, vận ủộng tắm chải vào buổi sỏng, mựa hố núng ủược quạt mỏt và phun sương. Quản lý cỏ thể và phũng bệnh cho bũ ủược thực hiện nghiờm ngặt, kiểm tra thỳ y ủịnh kỳ
2 lần/năm.
- Chếủộ dinh dưỡng: bũ ủực giống trong nghiờn cứu, ủược ăn theo chế ủộ dinh dưỡng tớnh sẵn cho từng cỏ thể theo tiờu chuẩn NRC của Mỹ năm 1987, (Phần phụ lục 4, bảng 4.1).
+ Chếủộ khai thỏc tinh: bũ ủược khai thỏc theo cựng chếủộ 2 lần/ tuần. + Kiểm tra số lượng, chất lượng và sản xuất tinh ủụng lạnh trờn cựng quy trỡnh của Jica Nhật Bản, cựng mụi trường pha chế tinh gồm: mụi trường A khụng cú Glyceryl (Tris, Citric axit, Lactose, Raffinose, nước cất 2 lần, lũng ủỏ trứng gà, Peniciline, streptomycine) và mụi trường B gồm (mụi trường A + glycerol).
3.1.3. Thời gian nghiờn cứu
Từ thỏng 7 năm 2008 ủến thỏng 6 năm 2009.
3.2. Nội dung nghiờn cứu và chỉ tiờu theo dừi
3.2.1. Số lượng, chất lượng tinh dịch bũ ủực giống Brahman
- Thể tớch tinh dịch (V); (ml/lần) - Mầu sắc tinh dịch - Nồng ủộ tinh trựng (C); (tỷ/ml) - Hoạt lực tinh trựng (A); (%) - pH tinh dịch - Tỷ lệ tinh trựng sống (%) - Tỷ lệ tinh trựng kỳ hỡnh (K); (%)
- Tổng số tinh trựng tiến thẳng trong tinh dịch (VAC)
3.2.2. Khả năng sản xuất tinh ủụng lạnh của bũ ủực giống Brahman
- Tỉ lệ cỏc lần lấy tinh ủạt tiờu chuẩn (%)
- Số lượng tinh cọng rạ sản xuất ủược trong một lần khai thỏc tinh ủạt tiờu chuẩn (liều/lần khai thỏc)
- Hoạt lực tinh trựng sau giải ủụng (%)
- Tổng số liều tinh cọng rạ sản xuất ủược/con/năm
3.3. Phương phỏp nghiờn cứu
3.3.1. Sơủồ nghiờn cứu
ðỏnh giỏ khả năng sản xuất tinh ủụng lạnh của bũ Brahman tại Trạm nghiờn cứu và sản xuất tinh ủụng lạnh ủược thực hiện theo sơủồ sau:
Sơủồ 3.1. Sơủồ nghiờn cứu của ủề tài
3.3.2. Phương phỏp ủỏnh giỏ chỉ tiờu số lượng, chất lượng tinh dịch
- ðối tượng nghiờn cứu ủược chia làm 2 nhúm bũ (theo nguồn gốc giống): + Nhúm 1: 04 bũ ủực giống Brahman Cuba
+ Nhúm 2: 06 bũ ủực giống Brahman Australia - Phương phỏp ỏp dụng cho từng chỉ tiờu:
+ Thể tớch tinh dịch: Bằng quan sỏt trờn ống ủong cú chia vạch ml và ghi chộp vào sổ sỏch.
+ Màu sắc tinh dịch: Dựng mắt quan sỏt mầu sắc tinh dịch ngay sau khi lấy tinh và ghi chộp vào sổ sỏch.
Kết luận và ủề nghị Pha chế, sản xuất tinh ủụng lạnh cọng rạ Phõn tớch kết quả Khai thỏc tinh Bũ ủực giống Brahman Australia Bũ ủực giống Brahman CuBa Bũ ủực giống lấy tinh
ðỏnh giỏ, kiểm tra số lượng, chất lượng tinh dịch
+ Nồng ủộ tinh trựng: Bằng mỏy so màu Photomaster SDM4 của hóng MINITUB bằng cỏch dựng pipột hỳt 0,2 ml tinh dịch pha loóng trong 4 ml nước muối sinh lý 0,9%, hơi lắc nhẹ cho ủều và ủưa vào mỏy Photomaster SDM4. Chỉ số hiện trờn mỏy là nồng ủộ tinh trựng (tỷ/ml)
+ Hoạt lực tinh trựng: ðỏnh giỏ bằng kớnh hiển vi cú kết nối với màn