- Phương pháp PCR xác ựịnh M.hyopneumoniae theo quy trình của Viện Thú y và Bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm Ờ Khoa Thú y, trường đại học Nông
3.5.2. Cách tiến hành
3.5.2.1. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn:
- Lấy bệnh phẩm phổi có dấu hiệu bệnh tắch viêm phổi của những lợn nghi bệnh ốm hoặc chết ựược mổ khám. Lấy từ 1/3 khắ quản phắa dưới ựến hết lá phổi. Bảo quản gửi về phòng thắ nghiệm trong vòng 24 giờ.
- Mẫu sau khi lấy về ựược cấy trên các môi trường thông thường và ựặc biệt như: Nước thịt, thạch máu, thạch chocolate, thạch MacConkey. Nuôi cấy ở nhiệt ựộ 37oC với thời gian 24 giờ, 36 giờ tuỳ loài vi khuẩn. Căn cứ vào tắnh chất mọc trên các môi trường ựể chọn riêng biệt các khuẩn lạc.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
Hình 2.3. Sơ ựồ phân lập vi khuẩn
3.5.2.2. Phương pháp Semi-nested PCR
Sử dụng mẫu gồm phổi; hạch lâm ba; dịch ngoáy mũi hoặc dịch ngoáy hầu họng. Bệnh phẩm ựược ựồng nhất bằng cối chày sứ và pha thành huyễn dịch bệnh phẩm 10% với nước sinh lý. Ly tâm huyễn dịch ở 4000 vòng/phút trong 5 phút. Thu dịch nổi.
* Tách chiết ADN
- Lấy 200 ộl cho vào ống Eppendorf sạch
- Thêm vào 500 ộl dung dịch ly giải mẫu và 8 ộl Proteinase K. - Ủ 560C trong 90 phút
- Cho vào ống Eppendorf ựựng mẫu ựã ựược dung giải (nói trên) 200 ộl dung dịch PCI (Phenol Chloroform Isoamyl).
- Vortex trộn mẫu
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC - Lấy 450 ộl dịch nổi phắa trên
- Thêm vào 450 ộl isopropanol (tỷ lệ isopropanol: mẫu = 1:1) - Tủa ADN ở nhiệt ựộ phòng (25oC) trong vòng 15 phút
Phổi lợn bệnh ở các lứa tuổi Nuôi cấy trong các môi trường
Nước thịt, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate Phân lập, thuần khiết từng loại lạc khuẩn trên các môi trường thắch hợp
Nhuộm Gram kiểm tra hình thái
Kiểm ựịnh Ờ ựịnh loại vi khuẩn bằng các ựặc tắnh hình thái và sinh hoá Cấy vào thạch máu giữ giống
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
- Thu cặn ADN bằng cách ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC
- đổ bỏ dung dịch phắa trên, giữ cặn sau ly tâm - Rửa ADN bằng cồn 70%: 1ml/mẫu
- Ly tâm thu cặn ở 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC - Loại bỏ hoàn toàn cồn, giữ cặn ADN.
- để khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng/ 15 phút - Hòa tan ADN thu ựược bằng 30 ộl TE buffer.
* Thực hiện phản ứng PCR
Thành phần phản ứng semi-nested PCR: - Phản ứng PCR vòng ngoài:
Sinh phẩm/hóa chất Thể tắch (ộl)
i-Star master mix solution 17
MHP950-1L (10pmol/ul) 1
MHP950-1R (10pmol/ul) 1
Sợi khuôn ADN 1
Tổng thể tắch 20
- Phản ứng PCR vòng trong:
Sinh phẩm/hóa chất Thể tắch (ộl)
i-Star master mix solution 17
MHP950-1L (10pmol/ul) 1
MHP950-2R (10pmol/ul) 1
Sản phẩm PCR vòng ngoài 1
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45
- Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng ngoài, PCR vòng trong:
Giai ựoạn Bước Nhiệt ựộ
(oC) Thời gian (giây) Số vòng phản ứng Biến tắnh 94 300 1 Biến tắnh 94 30 Bắt mồi 52 30 PCR Kéo dài 72 90 35
Kéo dài cuối
cùng 72 600 1
Giữ 4 Cho ựến khi
dừng - Kiểm tra kết quả phản ứng:
Sản phẩm phản ứng PCR (vòng ngoài và vòng trong) ựược ựiện di trên thạch agarose 1% (pha trong dung dịch TBE 1X), trong vòng 30 phút ở hiệu ựiện thế 100V. Xác ựịnh vạch ựặc hiệu trên hộp ựèn tử ngoại (dựa vào kắch thước vạch ựược nhân lên so với kắch thước thiết kế).
3.5.2.3. Phương pháp thử khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn phân lập ựược với kháng sinh.
- Theo phương pháp của Kirby- Bauer (1966).
- Các chủng vi khuẩn phân lập ựược cấy vào môi trường nước thịt BHI, bồi dưỡng ở 370C/ 24h. Chuẩn bị thạch BHI trên ựĩa, ựể tủ ấm 10-20 phút trước khi dùng. Lấy 0,1-0,2 ml canh khuẩn cần kiểm tra, nhỏ vào ựĩa thạch và láng cho ựều, sau ựó ựể ựĩa thạch từ 3-5 phút cho khô nhưng không ựể quá 25 phút. Sau ựó dùng panh ựặt và ấn nhẹ các ựĩa giấy ựã tẩm các loại kháng sinh ựặt cách nhau khoảng 15 mm. Sau ựó ựặt các ựĩa giấy trên mặt thạch trong vòng 15 phút, lật úp ựĩa thạch và ựặt vào tủ ấm 370C.
đọc kết quả sau 16-18 giờ bằng cách ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn. Kết quả ựược ựánh giá:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46
+ đường kắnh trung bình của vòng vô khuẩn từ 20 mm trở lên, vi khuẩn ựạt tiêu chuẩn rất mẫn cảm với thuốc.
+ đường kắnh trung bình của vòng vô khuẩn từ 15-19 mm, vi khuẩn ựạt tiêu chuẩn mẫn cảm trung bình với thuốc.
+ đường kắnh trung bình của vòng vô khuẩn từ 10-14 mm, vi khuẩn ắt mẫn cảm với thuốc.
3.5.2.4. Xây dựng, thử nghiệm ựiều trị và phòng bệnh suyễn lợn * Xây dựng và thử nghiệm phác ựồ ựiều trị
Phác ựồ ựiều trị ựề nghị (phác ựồ 2a và 2b) ựược xây dựng căn cứ vào kết quả kiểm tra kháng sinh ựồ. được sử dụng trên những lợn nghi mắc bệnh suyễn tại các trại. Phác ựồ ựiều trị ựối chứng chắnh là phác ựồ ựã từng ựược sử dụng tại các trại (Phác ựồ 1a và 1b) và ựã có kết quả ựiều trị theo ựiều tra dịch tễ học hồi cứu. Thắ nghiệm ựược bố trắ như sau:
Phác ựồ Thành phần và cách sử dụng Số lợn ựược ựiều trị
1a Tiamulin 10%; tiêm bắp 1ml/8-12kg
thể trọng/ngày, dùng liên tục 5-7 ngày 215 1b Tylosin 10%; tiêm bắp 1ml/10-12kg
thể trọng/ngày, dùng liên tục 5-7 ngày 307 2a
Draxxin; tiêm bắp 1ml/40kg thể
trọng, tiêm 1 liều duy nhất 196
2b
Excede; tiêm bắp 1ml/10-20kg thể
trọng, chỉ tiêm 1 liều duy nhất. 227
* Xây dựng và thử nghiệm quy trình phòng bệnh
Quy trình phòng bệnh ựược sử dụng bao gồm 2 quy trình: - Quy trình 1: Phòng bệnh bằng vacxin
- Quy trình 2: Phòng bệnh bằng thuốc
Cả 2 quy trình ựều phải tuân thủ quy trình chung trong chăn nuôi lợn ựể ựảm bảo an toàn sinh học tối thiểu, gồm có:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47
- Hạn chế sự tham quan.
- Tuân thủ nghiêm ngặt quy ựịnh sát trùng trước khi vào trại. - Sử dụng thuốc sát trùng 1 lần/tuần.
Trong quá trình ựiều tra, tỷ lệ mắc bệnh suyễn lợn ựược thu thập từ nhiều trại và không có quy trình phòng bệnh tổng hợp của tất cả các trại. Tuy nhiên, ựể phòng và xử lý bệnh suyễn lợn, các trại ựã tiến hành các phương pháp thuộc những trường hợp sau:
Trường hợp 1: Sử dụng vắc xin suyễn nhưng không sử dụng vắc xin phòng các bệnh quan trọng khác về ựường hô hấp như: viêm màng phổi, tụ huyết trùng, tai xanh, cúm lợn, Ầ.
Trường hợp 2: Sử dụng vắc xin suyễn nhưng không tuân thủ quy trình chung về chăn nuôi như quy ựịnh về sát trùng và hạn chế sự tham quan
Trường hợp 3: Không sử dụng vắc xin suyễn, không sử dụng chương trình thuốc phòng các bệnh và cũng không tuân thủ quy trình chung về chăn nuôi
Việc thử nghiệm quy trình phòng bệnh ựược theo dõi với số lượng như sau:
- Quy trình 1: Áp dụng với 2793 lợn. Ghi chép kết quả về tỷ lệ mắc bệnh
- Quy trình 2: Áp dụng với 3682 lợn. Ghi chép kết quả về tỷ lệ mắc bệnh
Kết quả thử nghiệm phòng bệnh suyễn lợn sẽ ựược so sánh với kết quả ựiều tra tình hình bệnh suyễn ựể ựánh giá hiệu quả phòng bệnh của quy trình.
3.5.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thu ựược trong các thắ nghiệm ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007, WinEpiscope 2.0 và Minitab 14.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48