3. Nội dung, nguyên liệu, ph−ơng pháp nghiên cứu
3.2.nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
Động vật thí nghiệm
+ Gà h−ớng trứng 1 ngày.
+ Thức ăn đq đ−ợc tiêu chuẩn hóa.
Vacxin
+ Vacxin của WEIKER-Trung Quốc vô hoạt H5N2 dạng nhũ dầu màu trắng sữa.
Đây là vacxin chứa kháng nguyên vô hoạt cúm gia cầm subtype H5 (H5N28): A/gà tây/Anh/N28/73
Các hoá chất dùng trong xét nghiệm
* Môi tr−ờng và hoá chất bảo quản bệnh phẩm
- Môi tr−ờng 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò) có bổ sung kháng sinh.
Penicillin G 2.000.000U/l Streptomycin 200 mg/l Polymyxin B 2.000.000 U/l Gentamicin 250 mg/l Nystatin 500.000 U/l Ofloxacin HCl 60 mg/l Sulfamethoxasole 200 mg/l - Môi tr−ờng Glycerol Pha chế PBS NaCL 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g N−ớc cất vđ 1000 ml
Hấp vô trùng 1210C/ 15 phút, bổ sung kháng sinh có trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1.
* Chuẩn bị các dung dịch và xử lý huyết thanh
- Dung dich PBS 0,01M pH7.2
Na2HPO4 1,096 g
NaH2PO4..H2O 0,316 g
Na Cl 8,5 g
N−ớc cất 1 lit
Chỉnh pH = 7.2 băng NaOH 1N hoăc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch n−ớc muối sinh lý 0,85%:
8,5 g NaCl trong 1 lít n−ớc cất.
Hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
+ Máu gà trống khoẻ mạnh đq tr−ởng thành, không có kháng thể cúm và Newcastle.
+ Dùng bơm tiêm 5 - 10ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống đông (Natri Citrat 4%) rồi lấy máu gà cho máu vào ống nghiệm.
+ Ly tâm1000 - 1500 vòng/phút,trong 15 phút, hút bỏ huyết t−ơng, cho thêm n−ớc sinh lý(NaCl 0,85%) vào hồng cầu,lắc đều.Ly tâm nh− trên3- 4 lần để rửa hồng cầu,sau lần ly tâm cuối hút bỏ n−ớc ở trên.
+ Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% bằng cách pha 1 mlhồng cầu với 99 mln−ớc muối sinh lý.
+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ4 - 8oC. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4 - 5ngày(nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ không dùng).
* Kháng huyết thanh chuẩn:
- Kháng huyết thanh chuẩn trên các loài nh− thỏ, dê, cừu... cần đ−ợc xử lý bằng RDE (Receptor Destroying Enzyme) tr−ớc khi xét nghiệm.
- Kháng huyết thanh chế trên gà không cần xử lý bằng RDE. Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả là d−ơng tính.
- Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ - 20oC, xử lý kháng huyết thanh vô hoạt yếu tố ức chế đặc hiệu.
- Trộn 3 phần RDE với 1 phần kháng huyết thanh ủ ở nhiệt độ 37oC trong nồi đun cách thuỷ qua đêm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 56oC/30 phút để vô hoạt RDE còn d−. - Kháng huyết thanh đq xử lý để nguội cho thêm 6 phần n−ớc sinh lý (0,3ml HT + 1,8ml SL), độ pha loqng cuối cùng của kháng huyết thanh là 1/10.
Lấy mẫu huyết thanh
- Mẫu huyết thanh: lấy 3 - 5 ml máu gia cầm vào ống nghiệm để nghiêng, chờ máu đông chắt lấy huyết thanh.
Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C trong vòng một tuần, nếu giữ ở nhiệt độ - 200C sẽ bảo quản lâu hơn,