3. Nội dung, nguyên liệu, ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
Ph−ơng pháp thu thập số liệu, lấy mẫu ngẫu nhiên, khách quan, trung thực. Ph−ơng pháp vận chuyển, bảo quản, sử dụng vacxin và kỹ thuật tiêm phòng thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất vacxin.
Xác định hiệu giá kháng thể và độ dài miễn dịch của gà mẹ, gà con, lòng đỏ trứng, bằng phản ứng HI.
Xử lý số liệu bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học trên Excel.
Phản ứng HI - Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên chuẩn: Kháng nguyên là virus cúm subtyp H5 chuẩn. Pha kháng nguyên H5 cho phản ứng HI là 4 đơn vị HA/25àl.
+ Hồng cầu gà 1%
+ Huyết thanh: Huyết thanh làm phản ứng đ−ợc chắt từ mẫu máu gà thí nghiệm và máu gà đối chứng, bảo quản ở 4-80C.
• Phản ứng ng−ng kết hồng cầu ( HA)
Phản ứng HA dùng để chuẩn độ kháng nguyên chuẩn H5 và kháng nguyên (là virus) phân lập từ bệnh phẩm. Dùng đĩa làm phản ứng ng−ng kết đáy chữ U gồm 12 cột và 8 hàng.
+ Tiến hành phản ứng:
Cho 25àl PBS (pH 7,2) vào tất cả các giếng.
Cho 25 àl kháng nguyên chuẩn hoặc kháng nguyên phân lập vào các giếng từ.
Pha loqng bậc 2 kháng nguyên kiểm tra. Chuyển 25 àl từ giếng 1 đến giếng 11 rồi bỏ đi 25 àl.
Cột 12 dùng làm đối chứng, chỉ chứa: 25 àl PBS và 25 àl hồng cầu gà 1%.
Cho 25 àl hồng cầu gà 1% vào các giếng phản ứng.
Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đọc kết quả.
Phản ứng (-) : hồng cầu lắng đều ở d−ới đáy.
Phản ứng (+): xảy ra hiện t−ợng ng−ng kết, hồng cầu ng−ng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.
Đọc hiệu giá ng−ng kết: hiệu giá ng−ng kết kháng nguyên đ−ợc đánh giá ở độ pha loqng cao nhất còn có phản ứng ng−ng kết xảy ra.
• Phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu (HI)
Nhỏ 25 àl PBS vào các giếng đáy chữ V của đĩa 96 giếng. Nhỏ tiếp 25 àl huyết thanh vào giếng đầu tiên.
Pha loqng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 àl huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cùng.
Nhỏ 25 àl kháng nguyên 8 HA đq chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1-11. Thêm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12)
Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu 1% vào tất cả các giếng của đĩa, lắc đều. Để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút.
Đọc kết quả: phản ứng (+) d−ơng tính nếu hồng cầu lắng xuống đáy thanh cục tròn. Hiệu giá HI của mẫu đ−ợc tính ở độ pha loqng huyết thanh cao nhất còn có hiện t−ợng ức chế ng−ng kết hồng cầu.
Theo quy định 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn:
Ng−ỡng bảo hộ, hiệu giá (HI) = 4 log2. Kháng thể cao, hiệu giá (HI) > 4 log2. Không đ−ợc bảo hộ, hiệu giá (HI) < 4 log2.