Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường Trường Đại học Lạc Hồng.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.2.1. Phương pháp phân lập:
Môi trường phân lập nấm mốc được sử dụng là môi trường PGA. Các chủng nấm mốc được phân lập từ các mẫu bánh men cơm rượu. Bánh men
được bẻ làm đôi, lấy một ít bánh men ở giữa rải đều lên bề mặt đĩa petri chứa môi trường PGA, sau đó đem để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau khi nấm mốc mọc trên bề mặt môi trường của đĩa petri. Dùng que cấy chuyển nấm mốc qua đĩa petri có chứa môi trường PGA mới để làm thuần. Nấm mốc sau khi làm thuần được cấy vào ống nghiệm và được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C
để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái nấm mốc: a. Quan sát khuẩn lạc nấm mốc: a. Quan sát khuẩn lạc nấm mốc:
Cấy chủng nấm mốc lên môi trường PGA, đểở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau đó quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc nấm mốc trên đĩa như: màu sắc, hình dạng sợi nấm và đo kích thước khuẩn lạc.
b. Quan sát tế bào nấm mốc dưới kính hiển vi:
Làm tiêu bản tế bào nấm mốc trong xanh methylen, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học.
2.2.2.3. Phương pháp xác định khả năng phân giải tinh bột:
Môi trường sử dụng để xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc là môi trường thạch – tinh bột. Cấy chủng nấm mốc lên môi trường thạch - tinh bột, để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau đó, đổ dung dịch Lugol lên môi trường thạch - tinh bột. Nếu có vòng phân giải xung
quanh khuẩn lạc thì chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột, nếu không có vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm mốc không có khả năng phân giải tinh bột, dùng thước đo vòng phân giải tinh bột và ghi nhận kết quả.
2.2.2.4 Phương pháp thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc [6]
Thu nhận chế phẩm enzyme amylase theo phương pháp nuôi cấy chìm:
Hình 2.1: Quy trình thu nhận enzym amylase từ nấm mốc 100 ml MT PGA lỏng Giống nấm mốc Lắc 200v/p trong 48 giờ ở t0 phòng Thu dịch lỏng, bỏ cặn Ly tâm 6000v/p trong 5 phút Tủa bằng cồn 960 lạnh
Giữ lạnh ở 40C trong 24 giờ
Ly tâm ở 6000v/p trong 20 phút Thu cặn, bỏ dịch Sấy dưới 400C Enzyme bán tinh khiết
Chuẩn bị 100ml môi trường trong erlen 250ml. Đem tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút và để nguội. Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống nghiệm giống nấm mốc, khuấy nhẹ để các bào tử hòa trong nước. Đổ toàn bộ
10ml dịch trong ống nghiệm này vào trong erlen 250ml có 100ml môi trường. Tất cả thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Đặt các erlen này vào máy lắc có tốc độ 200 v/p nuôi trong 48 giờ ở
nhiệt độ phòng. Sau đó, đem ly tâm, thu lấy dịch. Dịch nuôi cấy này có chứa enzyme hòa tan. Bảo quản dịch nuôi cấy này trong tủ lạnh 40C. Dùng 200ml cồn 960 lạnh đổ từ từ vào 100ml dịch lọc enzyme đã làm lạnh, khuấy rất nhẹ để cồn hòa đều với dịch enzyme. Sau đó, để hỗn hợp này vào tủ lạnh. Sau 24 giờ, hỗn hợp sẽ phân thành hai lớp.
Đem ly tâm để thu enzyme dạng tủa. Enzyme dạng tủa này còn chứa nhiều nước. Nước tồn tại trong đó sẽ làm giảm hoạt tính enzyme. Do đó, cần phải loại nước bằng cách sấy ở nhiệt độ <400C, ta có chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết.
2.2.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme amylase: [5],[7]
Hoạt độ enzyme amylase đặc trưng cho khả năng thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase tới dextrin cho màu với iodine khác với màu của tinh bột ban
đầu.
Đơn vị hoạt độ enzyme amylase là lượng enzyme xúc tác thủy phân 1g tinh bột tan ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ với pH = 4,7.
Cho vào 2 erlen 50ml, mỗi erlen 10ml dung dịch tinh bột 1%. Đặt vào máy ủ nhiệt ở 300C, giữ 10 phút. Thêm vào erlen 2 (erlen thí nghiệm) 5 ml dịch chiết enzyme. Khuấy đều và giữ 10 phút. Lấy từ mỗi erlen 0,5 ml hỗn
hợp cho vào 2 erlen khác có chứa 50 ml dung dịch iodine, lắc đều. Erlen đối chứng có màu xanh, erlen thí nghiệm có màu tím. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 656nm. Mật độ quang của erlen đối chứng (OD1) là lượng tinh bột ban đầu.
Mật độ quang của erlen thí nghiệm (OD2) là lượng tinh bột còn lại sau khi bị
α-amylase thủy phân. Sự khác nhau giữa mật độ quang của erlen đối chứng và erlen thí nghiệm là lượng tinh bột bị enzyme amylase thủy phân.
- Lượng tinh bột bị thủy phân: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0,1 1 2 1 − × = OD OD OD C (g)
Trong đó: OD1 – mật độ quang của dung dịch đối chứng, OD2 – mật độ quang của dung dịch nghiên cứu, 0,1 – lượng tinh bột phân tích (g).
- Hoạt độ enzyme amylase của chế phẩm enzyme từ nấm mốc: 1000 03766 , 0 . 264 , 7 − × = w C HdAn (đv/g)
Trong đó: w – lượng chế phẩm enzyme amylase đem thí nghiệm (mg). C – lượng tinh bột bị thủy phân (g).
1000 – hệ số chuyển miligam thành gam.
7,264; 0,03766 là các hệ số của phương trình tính hoạt độ thu được bằng phương pháp xử lý toán học số liệu thực nghiệm về sự phụ
thuộc của lượng tinh bột bị thủy phân và lượng enzyme lấy để
nghiên cứu. Trong các hệ số này có đưa vào thừa số tính chuyển thành 1 giờ tác dụng của enzyme.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu:
- Từ 8 mẫu bánh men lấy ở những địa điểm khác nhau, chúng tôi đã phân lập được 11 chủng nấm mốc theo bảng 3.1:
Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu
STT Chủng Mẫu 1 M1 HA 2 M2 HA 3 M3 TĐ 4 M4 TĐ 5 M5 Q9 6 M6 Q9 7 M7 Q5 8 M8 LBT 9 M9 BH 10 M10 BL 11 M11 BD
Qua bảng trên thấy rằng từ các mẫu bánh men HA, TĐ và Q9 mỗi mẫu chúng tôi phân lập được 2 chủng nấm mốc, riêng các mẫu bánh men Q5, LBT, BH, BL, BD mỗi mẫu chỉ phân lập được 1 chủng nấm mốc. Dưới đây là một số hình ảnh khuẩn lạc nấm mốc mà chúng tôi đã phân lập được:
Hình 3.1: Khuẩn lạc của các chủng nấm mốc M2, M4, M7, M10 a. Chủng M2 b. Chủng M4
3.2. Kết quả quan sát hình thái nấm mốc:
Sau khi quan sát khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập được từ
các mẫu bánh men, chúng tôi ghi nhận một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc nhưở bảng 3.2:
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc đã phân lập từ bánh men cơm rượu STT Chủng Kích thước (2 ngày) Tốc độ phát triển Màu sắc Hình dạng sợi nấm 1 M1 7.7 cm Nhanh Trắng Dạng bông 2 M2 6 cm Nhanh Màu xám, viền trắng Dạng bông 3 M3 8.8 cm Nhanh Trắng Dạng bông 4 M4 3.9 cm Vừa phải Trắng xám, nhạt Dạng bông, dày đặc 5 M5 7.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 6 M6 6 cm Nhanh Màu xám, viền trắng Dạng bông 7 M7 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 8 M8 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 9 M9 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 10 M10 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 11 M11 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông
Qua bảng trên cho thấy rằng, về đặc điểm hình dạng sợi nấm: đa số các chủng nấm mốc phân lập được đều có dạng bông, riêng chủng nấm mốc M4 có dạng bông dày đặc.
- Về màu sắc khuẩn lạc: các chủng nấm mốc M1, M3, M5, M7, M8, M9, M10, M11 phân lập từ bánh men đều có màu trắng. Các chủng nấm mốc có màu xám, viền trắng là M2 và M6. Riêng chủng nấm mốc M4 thì có màu trắng, xám nhạt.
- Về kích thước khuẩn lạc nấm mốc trong 2 ngày sau khi cấy, có kích thước từ 3,9 – 9, 5 cm.
- Tốc độ phát triển của các chủng nấm mốc phân lập được đều nhanh. Riêng chủng M4 có tốc độ phát triển vừa phải.
Sau khi quan sát dưới kính hiển vi, dựa vào khóa phân loại của TS.
Đặng Vũ Hồng Miên, chúng tôi đã phân loại sơ bộ được 3 chủng đến giống: - Chủng M4 thuộc giống Mucor.
- Chủng M2 và M6 thuộc giống Rhizopus.
Do điều kiện hạn chế về thời gian, thiết bị máy móc cũng như hóa chất, chúng tôi chỉ phân loại sơ bộđược 3 chủng nấm mốc đến giống.
3.3. Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc : mốc :
Kết quả thí nghiệm xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc cho thấy 9 chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 có khả năng tạo vòng phân giải tinh bột và 2 chủng: M2, M6 không có khả năng tạo vòng phân giải tinh bột.
Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột do đó chúng có khả
năng tạo ra enzyme amylase. Nấm mốc tạo ra enzyme amylase phân giải liên kết 1,4 – glycoside ở giữa chuỗi tạo thành dextrin phân tử thấp. Dưới tác dụng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
của enzyme amylase, tinh bột trong môi trường nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch iodine.
Như vậy, 9 chủng nấm mốc: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 có khả năng tạo enzyme amylase và 2 chủng nấm mốc: M2, M6 không có khả năng tạo enzyme amylase. Kết quả đo vòng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc theo bảng 3.3:
Bảng 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc phân lập từ
bánh men cơm rượu
STT Chủng Đường kính phân giải tinh bột (cm)
1 M1 1,85 2 M2 - 3 M3 3,1 4 M4 2,25 5 M5 1,55 6 M6 - 7 M7 1,25 8 M8 2,6 9 M9 2,75 10 M10 2,1 11 M11 2,23
Qua kết quả thí nghiệm khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc
đã cho thấy các chủng nấm mốc phân lập được từ bánh men có đường kính phân giải từ 1,25 – 3,1 cm. Trong đó có 2 chủng nấm mốc không có khả năng phân giải tinh bột là chủng M2 và M6. Khả năng phân giải tinh bột của chủng M3 là lớn nhất có vòng phân giải là 3, 1 cm, trong khi đó chủng M7 có khả
a. Chủng M3 b. Chủng M4
Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M3, M4, M9, M11
Hình 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M6, M7
3.4 Kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc:
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn, chúng tôi chỉ sử dụng chủng nấm mốc M4 để thu nhận enzyme amylase. Chúng tôi chỉ chọn chủng M4 để thu nhận amylase vì lý do sau:
Chủng M4 là 1 trong 9 chủng nấm mốc phân lập được từ bánh men có khả năng phân giải tinh bột cho vòng phân giải tương đối lớn là 2,25 cm.
Chủng M4 đã được định danh sơ bộ là giống Mucor.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, từ 1 lít môi trường nuôi cấy chủng M4, chúng tôi thu nhận được 1,23 g chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết. Theo tài liệu tham khảo [8], thông thường bằng phương pháp nuôi bề sâu, từ 1 lít môi trường nuôi cấy thu được từ 1 – 4 gam chế phẩm enzyme khô.
Dưới đây là một số hình ảnh trong quá trình thu nhận enzyme amylase bán tinh khiết từ chủng nấm mốc M4.
Hình 3.6: Chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết từ nấm mốc
3.5. Kết quả xác định hoạt độ của enzyme amylase bán tinh khiết:
Mật độ quang của dung dịch đối chứng: OD1 = 0,023
Mật độ quang của dung dịch nghiên cứu: OD2 = 0,014
- Lượng tinh bột bị thủy phân:
039 , 0 1 , 0 023 , 0 014 , 0 023 , 0 1 , 0 1 2 1 − × = − × = = OD OD OD C (g) - Hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme: 72 , 4912 1000 05 , 0 03766 , 0 039 , 0 . 264 , 7 1000 03766 , 0 . 264 , 7 − × = − × = = w C HdAn (đv/g)
Chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết mà chúng tôi thu nhận được từ chủng nấm mốc M4 có hoạt độ cao là 4912,72 đv/g, điều này có ý nghĩa quan trọng góp phần tạo ra nguồn enzyme amylase có giá trị từ chủng nấm mốc này và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực không những trong ngành công nghiệp thực phẩm mà còn trong các ngành khác như: ngành công nghiệp dệt, sản xuất chất tẩy rửa, y học, chăn nuôi …
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN:
Sau một thời gian tiến hành nghiên cứu, chúng tôi đã:
• Phân lập được 11 chủng nấm mốc từ bánh men cơm rượu ở 8 địa điểm khác nhau.
• Định danh sơ bộ được 3 chủng đến giống: Chủng M4: giống Mucor
Chủng M2 & M6: giống Rhizopus
• Trong đó có 9 chủng nấm mốc đều có khả năng phân giải tinh bột bao gồm các chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 và 2 chủng không có khả năng phân giải tinh bột là chủng M2, M6. Như vậy, 9 chủng nấm mốc có khả năng tạo enzyme amylase, 2 chủng nấm mốc không có khả năng tạo enzyme amylase. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán tinh khiết theo phương pháp nuôi cấy chìm.
• Từ 1 lít môi trường nuôi chủng M4 thu được 1,23 g chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết.
• Chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết thu được có hoạt độ cao là 4912,72 đv/g.
4.2. KIẾN NGHỊ:
Do thời gian có hạn và điều kiện máy móc thiết bị còn hạn chế, chúng tôi không thể tiến hành các nghiên cứu sâu hơn. Với những kết quả đạt được, chúng tôi đề nghị:
• Tiến hành định danh các chủng đến loài.
• Nghiên cứu tối ưu quá trình sản xuất enzyme amylase để thu được lượng enzyme tối đa, chất lượng với chi phí thấp.
• Nghiên cứu sản xuất enzyme amylase từ các chủng khác có khả năng phân giải tinh bột ngoài chủng M4.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Nguyễn Văn Bá – Cao Ngọc Điệp – Nguyễn Văn Thành, Giáo trình môn
Nấm học, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học – Trường ĐH Cần Thơ, 2005.
[2] Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh học học, NXB Giáo Dục, số 04 – 2009/CXB/301 – 2117/GD.
[3] Bùi Xuân Đồng, Nguyên lý phòng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB
Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 2003
[4] Nguyễn Thị Hiền (Chủ Biên), Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền, NXB Khoa học và Kỹ thuật – ĐH Bách Khoa Hà Nội, 2006.
[5] Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên), Cao Cường – Nguyễn Ánh Tuyết – Lê Thị Thủy Tiên – Tạ Thu Hằng – Huỳnh Ngọc Oanh – Nguyễn Thúy Hương – Phan Thị Huyền, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh Trường ĐH Bách Khoa, 2004.
[6] Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) – Phan Thị Huyền – Nguyễn Ánh Tuyết,
Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ĐH Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2006.
[7] Nguyễn Văn Mùi, Thực hành Hóa sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2000.
[8] Đồng Thị Thanh Thu, Sinh hóa ứng dụng (Trong công nghiệp thực phẩm và một số lĩnh vực khác), NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh Trường
ĐH Khoa học Tự nhiên, 2003.
TÀI LIỆU TRÊN MẠNG [9].http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Mature_sporangium_of_a_Muco r_sp._fungus _PHIL_3960_lores.jpg [10].http://muivi.com/muivi/index.php?option=com_content&task=view&id= 3087&Itemid=431 [11].http://vi.wikipedia.org/wiki/N%E1%BA%A5m