1.4.5.1. Sinh tổng hợp enzyme amylase ở vi sinh vật:
Khi nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tạo ra enzyme amylase trong tế bào hay ngoài môi trường. Ở một số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase xảy ra song song với quá trình sinh trưởng, sự tạo ra enzyme amylase phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng sinh khối. Sự tạo thành enzyme amylase cực đại xảy ra sau khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng.
1.4.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp enzyme amylase: amylase:
a. Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Nguồn nitơ trong môi trường dinh dưỡng của phương pháp nuôi bề sâu có thể là muối vô cơ hay các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. NaNO3 là nguồn nitơ
dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm mốc tạo enzyme amylase. Cho nguồn nitơ
nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp enzyme amylase này và
ức chế tổng hợp enzyme amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường bị axit hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp nhiều glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase.
Sự tạo glucoamylase cũng như α-amylase cực đại thường thấy ở các nồng độ nitơ cao (0,25 – 0,4%), khi làm môi trường nuôi vi khuẩn tạo enzyme amylase thường dùng (NH4)2HPO4. Nguồn nitơ hữu cơ như: galatin, casein, nước chiết ngô đảm bảo cho Aspergillus awamori sinh trưởng tốt, nhưng không tăng cường tổng hợp các enzyme amylase. Thêm nước chiết mầm
mạch hay nước chiết ngô cũng như các amino axit đều làm tăng sinh tổng hợp
α-amylase ngoại bào, song hiệu quả kém hơn NaNO3. Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme amylase. Trong môi trường có
đủ lượng carbon và nitơ cần thiết mới tạo được enzyme cực lớn.
b. Ảnh hưởng của amino acid:
Amino acid là những cấu tử hợp thành enzyme. Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase do các nguyên nhân sau:
• Một số amino acid đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác và trong quá trình chuyển amine hóa.
• Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như: biotin, folic acid…
Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một số thì ức chế quá trình, một số không có ảnh hưởng gì.
c. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng khoáng:
Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật.
• Mg 2+: có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme amylase. Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng đến sự tổng hợp mọi enzyme amylase của nấm mốc. Khi đó, sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn, còn lượng glucoamylase giảm xuống. Nồng độ tối ưu của muối này cho sinh tổng hợp α-amylase và glucoamylase là 0.05%.
• Phospho: cần để tổng hợp các hợp chất quan trọng của nucleic phospholipid acid và nhiều coenzyme, đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm mốc và các vi sinh vật khác, do vậy mà tăng cường tổng hợp các enzyme amylase.
• Calcium: cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu của enzyme này, có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của proteinase.
• Lưu huỳnh: kích thích sự tạo amylase vì lưu huỳnh có trong thành phần cảu các amino axit quan trọng như: methionine, cystein. Nguồn lưu huỳnh tốt nhất để tạo enzyme amylase là methionine , có thể dùng các muối sulfate ngoại trừ CuSO4.
• Nhiều nguyên tố vi lượng có ảnh hưởng tới sự tăng sinh khối và tổng hợp các enzyme amylase như Coban có tác dụng kích thích tổng hợp enzyme amylase, trong sinh sản và hoạt động sống của vi sinh vật. Mn, Cu, Hg kìm hãm sinh tổng hợp enzyme amylase ở vi sinh vật trong pH môi trường.
d. Ảnh hưởng của pH nguyên liệu:
Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt thì pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp nên pH không thay đổi nhiều.Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ
tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo enzyme amylase. Nếu dùng nước máy
để làm ẩm cám thì pH môi trường là 5 – 6. Nếu dùng HCl, H2SO4 và axit lactic để làm ẩm thì pH môi trường giảm đến 4,5 – 5,0 tạo điều kiện chọn lọc cho nấm mốc phát triển. Ở pH 4,5 – 5,0 nấm mốc tạo enzyme amylase tốt nhất.
1.4.5.3. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase:
a. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt:
Thành phần chính của môi trường vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo. Đó là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là thành phần duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật mà không cần phải bổ sung thêm các chất khác nữa.
Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các enzyme amylase. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%, nên dùng cám tốt, cám mới không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độ không quá 0,05%... Thành phần bổ sung được đưa vào môi trường có thể là chất làm xốp môi trường hoặc làm giàu thêm chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng mà ở cám không có đủ. Thành phần này thường là mầm mạch, trấu, mùn cưa… Cám và các chất phụ gia chứa nhiều vi sinh vật khác cần phải thanh trùng để đảm bảo môi trường không có vi sinh vật ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 1,5 atm trong vòng 4 - 6 giờ.
Độ ẩm tối thích của môi trường: trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban
đầu tối thích của môi trường đối với Aspergillus niger, Aspergillus awamori,
Aspergillus oryzae là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độẩm mà quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme amylase.
Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dãy khay. Ở giai
đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 – 5 lần thể
tích không khí trên một thể tích phòng trong một giờ, ở giai đoạn thứ hai là 30 – 60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi trong 1 giờ, giai đoạn ba giảm
đi chỉ còn 10 – 12 thể tích không khí.
Nhiệt độ nuôi: Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám chia làm ba thời kỳ:
• Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ đầu tiên, vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng
không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc. Độ ẩm tương đối của không khí là 96 – 100%.
• Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi kéo dài trong 4 – 18 giờ. Ở giai
đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý lớn. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi khoảng 28 – 290C.
• Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ kéo dài từ 10 – 20 giờ. Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh. Các enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so với giai đoạn
đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28 – 300C.
Thời gian nuôi để có lượng enzyme amylase cực lớn: Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme amylase mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực enzyme. Đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo enzym amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử.
b. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề sâu:
Môi trường dinh dưỡng: môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase là có chất cảm ứng là tinh bột, dextrin hay maltose. Để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tốt và sinh nhiều enzyme amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành…
Độ axit của môi trường được xác định bởi thành phần và tính chất của các muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi vi sinh vật, pH của môi trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ . Nếu thêm vào môi trường các muối ammonium thì khi vi sinh vật tiêu thụ ion ammonium, các anion được giải phóng ra sẽ axit hóa môi trường. Vì thế cần phải thêm CaCO3 vào để trung hòa hoặc duy trì giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp enzyme amylase.
Nhiệt độ nuôi: là một yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm mốc thuộc giống Aspergillus là 30 – 320C, Bacillus subtilis là 370C.
Sục khí và khuấy trộn. Phần lớn vi sinh vật tạo enzyme amylase là những vi sinh vật hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng, vi sinh vật sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Vì thế việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase của vi sinh vật. Chế độ sục khí đối với nấm mốc là 10 – 12 m3 không khí vô trùng trên 1 m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi khoảng 68 – 72 giờ.
1.4.6. Ứng dụng của enzyme amylase:
Chế phẩm enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp -
đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm, sau đây là một số ứng dụng quan trọng của enzyme amylase:
1.4.6.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia:
Chế phẩm enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus
awamori, Aspergillus usamii, Aspergillus niger, Rhizopus delemar hoặc từ
Endomycopsis bispora, từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus
được thay thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu,bia từ
nguyên liệu có bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất.
Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và
đóng vai trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường lên men, do vậy cần chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều glucoamylase. Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt hay bề sâu của các nấm mốc. Ở Việt Nam chúng ta dùng canh trường bề mặt của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Aspergillus awamori và Rhizopus delemar đểđường hóa. Ở một số nước, ngoài enzyme amylase nấm mốc người ta còn sử dụng enzyme amylase từ vi khuẩn, nấm men cũng cho kết quảđường hóa khá cao.
Chế phẩm enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus chịu nhiệt độ cao, dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột lúc đầu, trước khi đường hóa rất tốt. Ở nhiệt độ 80 - 900C trong 10 - 15 phút α- amylase của vi khuẩn bị vô hoạt một phần rất nhỏ.
Trong sản xuất bia, thường dùng Aspergillus oryzae và Bacillus
subtilis đểđường hóa thay malt, là nguyên liệu khá đắt tiền và cần thiết trong sản xuất bia. Dùng chế phẩm enzyme này người ta có thể thay từ 50 - 100% malt bằng đại mạch không nảy mầm, thay thế 50 - 60% malt thì chất lượng
bia tốt hơn. Khi dùng chế phẩm enzyme vi sinh vật thay malt, cần bổ sung nguồn nguyên liệu có bột như các loại ngũ cốc như: bắp, khôi, sắn, gạo, đại mạch không nảy mầm, tiểu mạch. Biện pháp thay thế malt bằng chế phẩm enzyme như trên có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc giảm giá đáng kể
giá thành của sản phẩm, mà chất lượng bia vẫn bảo đảm.
1.4.6.2. Trong sản xuất bánh mì
Trong sản xuất bánh mì người ta thường sử dụng chế phẩm enzyme amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay của vi khuẩn, nhưng chế phẩm từ nấm mốc áp dụng có hiệu quả và rộng rãi hơn.
Dùng với lượng 0,002 - 0,05% chế phẩm enzyme amylase so với bột nhão sẽ tăng cường quá trình lên men bột, rút ngắn thời gian lên men xuống 20 - 30%, tăng độ xốp 5 - 8%, tăng thể tích bánh lên men 15 - 25% màu sắc vỏ bánh đẹp hơn, ruột bánh xốp và sáng màu hơn tăng hương vị thơm ngon của bánh. Khi làm bánh mì ngọt, nếu thêm chế phẩm enzyme amylase vào bột, sẽ xảy ra quá trình thủy phân bột thành đường, do đó giảm lượng đường tiêu tốn cho sản xuất.
1.4.6.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco
Từ lâu các sản phẩm mật tinh bột như: mật gluco, mật malto… được sản xuất bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng axit hay bằng malt. Ngày nay người ta sử dụng rộng rãi chế phẩm enzyme amylase vi sinh vật trong sản xuất mật tinh bột, gluco, malto từ nguyên liệu tinh bột.
Ở các nước tiên tiến khác, phương pháp dùng enzyme từ vi sinh vật trong lĩnh vực này cũng đã được áp dụng có hiệu quả và phổ biến, hay phối hợp phương pháp axit và enzyme. Trong sản xuất mật tinh bột, gluco, hai enzyme chủ yếu là amylase và glucoamylase từ nấm mốc và vi khuẩn.
Enzyme α-amylase để dịch hóa tinh bột và tạo malto, còn glucoamylase dùng
để đường hóa tạo gluco, chế phẩm amylase cho sản xuất gluco được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus sublitis, Bacillus mesentericus. Chế phẩm glucoamylase thường sản xuất từ nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Rhizopus delamar, Mucor… hay từ một số nấm men Saccharomyces,
Endomycopsis…
1.4.6.4. Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác
Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác như bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp, nước ép trái cây, tương … Chế phẩm enzyme amylase giúp cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường, làm trong các thành phần dạng lỏng, dễ cô đặc, tăng lượng đường trong sản phẩm, giảm lượng đường tiêu tốn, tăng lượng đường đơn giản dễ hấp thu cho người, đặc biệt là thức ăn cho trẻ em, giảm thời gian nấu, chế biến …
Hiện nay người ta dùng hỗn hợp các enzyme: protease, amylase, pectinase trong sản xuất các sản phẩm trên, tạo sản phẩm dễ tan, dễ tiêu hóa màu sắc đẹp, dễ lọc, dễ cô đặc, rút ngắn thời gian sản xuất, giảm giá thành sản phẩm…
1.4.6.5. Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy
Trong công nghiệp dệt, chế phẩm enzyme amylase của vi khuẩn
Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus diastaticus, Bacillus amylosolvens… có tính ưu việt chịu nhiệt cao, dùng trong rũ hồ vải, tạo điều kiện tốt dễ dàng khi nhuộm, tẩy vải sau này. Ngoài ra người ta còn dùng chế
1.4.6.6. Trong chăn nuôi
Chế phẩm enzyme amylase được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp với các enzyme khác như: protease, cenlulase, pectinase … để sản xuất các loại thức
ăn dễ tiêu hóa, hấp thu trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Sử dụng thức ăn có chế phẩm enzyme amylase sẽ làm tăng khả năng hấp thu, tiêu hóa do đó giảm