a. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt:
Thành phần chính của môi trường vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo. Đó là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là thành phần duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật mà không cần phải bổ sung thêm các chất khác nữa.
Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các enzyme amylase. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%, nên dùng cám tốt, cám mới không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độ không quá 0,05%... Thành phần bổ sung được đưa vào môi trường có thể là chất làm xốp môi trường hoặc làm giàu thêm chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng mà ở cám không có đủ. Thành phần này thường là mầm mạch, trấu, mùn cưa… Cám và các chất phụ gia chứa nhiều vi sinh vật khác cần phải thanh trùng để đảm bảo môi trường không có vi sinh vật ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 1,5 atm trong vòng 4 - 6 giờ.
Độ ẩm tối thích của môi trường: trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban
đầu tối thích của môi trường đối với Aspergillus niger, Aspergillus awamori,
Aspergillus oryzae là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độẩm mà quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme amylase.
Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dãy khay. Ở giai
đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 – 5 lần thể
tích không khí trên một thể tích phòng trong một giờ, ở giai đoạn thứ hai là 30 – 60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi trong 1 giờ, giai đoạn ba giảm
đi chỉ còn 10 – 12 thể tích không khí.
Nhiệt độ nuôi: Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám chia làm ba thời kỳ:
• Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ đầu tiên, vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng
không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc. Độ ẩm tương đối của không khí là 96 – 100%.
• Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi kéo dài trong 4 – 18 giờ. Ở giai
đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý lớn. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi khoảng 28 – 290C.
• Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ kéo dài từ 10 – 20 giờ. Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh. Các enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so với giai đoạn
đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28 – 300C.
Thời gian nuôi để có lượng enzyme amylase cực lớn: Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme amylase mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực enzyme. Đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo enzym amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử.
b. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề sâu:
Môi trường dinh dưỡng: môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase là có chất cảm ứng là tinh bột, dextrin hay maltose. Để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tốt và sinh nhiều enzyme amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành…
Độ axit của môi trường được xác định bởi thành phần và tính chất của các muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi vi sinh vật, pH của môi trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ . Nếu thêm vào môi trường các muối ammonium thì khi vi sinh vật tiêu thụ ion ammonium, các anion được giải phóng ra sẽ axit hóa môi trường. Vì thế cần phải thêm CaCO3 vào để trung hòa hoặc duy trì giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp enzyme amylase.
Nhiệt độ nuôi: là một yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm mốc thuộc giống Aspergillus là 30 – 320C, Bacillus subtilis là 370C.
Sục khí và khuấy trộn. Phần lớn vi sinh vật tạo enzyme amylase là những vi sinh vật hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng, vi sinh vật sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Vì thế việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase của vi sinh vật. Chế độ sục khí đối với nấm mốc là 10 – 12 m3 không khí vô trùng trên 1 m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi khoảng 68 – 72 giờ.
1.4.6. Ứng dụng của enzyme amylase:
Chế phẩm enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp -
đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm, sau đây là một số ứng dụng quan trọng của enzyme amylase:
1.4.6.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia:
Chế phẩm enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus
awamori, Aspergillus usamii, Aspergillus niger, Rhizopus delemar hoặc từ
Endomycopsis bispora, từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus
được thay thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu,bia từ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nguyên liệu có bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất.
Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và
đóng vai trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường lên men, do vậy cần chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều glucoamylase. Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt hay bề sâu của các nấm mốc. Ở Việt Nam chúng ta dùng canh trường bề mặt của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Aspergillus awamori và Rhizopus delemar đểđường hóa. Ở một số nước, ngoài enzyme amylase nấm mốc người ta còn sử dụng enzyme amylase từ vi khuẩn, nấm men cũng cho kết quảđường hóa khá cao.
Chế phẩm enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus chịu nhiệt độ cao, dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột lúc đầu, trước khi đường hóa rất tốt. Ở nhiệt độ 80 - 900C trong 10 - 15 phút α- amylase của vi khuẩn bị vô hoạt một phần rất nhỏ.
Trong sản xuất bia, thường dùng Aspergillus oryzae và Bacillus
subtilis đểđường hóa thay malt, là nguyên liệu khá đắt tiền và cần thiết trong sản xuất bia. Dùng chế phẩm enzyme này người ta có thể thay từ 50 - 100% malt bằng đại mạch không nảy mầm, thay thế 50 - 60% malt thì chất lượng
bia tốt hơn. Khi dùng chế phẩm enzyme vi sinh vật thay malt, cần bổ sung nguồn nguyên liệu có bột như các loại ngũ cốc như: bắp, khôi, sắn, gạo, đại mạch không nảy mầm, tiểu mạch. Biện pháp thay thế malt bằng chế phẩm enzyme như trên có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc giảm giá đáng kể
giá thành của sản phẩm, mà chất lượng bia vẫn bảo đảm.
1.4.6.2. Trong sản xuất bánh mì
Trong sản xuất bánh mì người ta thường sử dụng chế phẩm enzyme amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay của vi khuẩn, nhưng chế phẩm từ nấm mốc áp dụng có hiệu quả và rộng rãi hơn.
Dùng với lượng 0,002 - 0,05% chế phẩm enzyme amylase so với bột nhão sẽ tăng cường quá trình lên men bột, rút ngắn thời gian lên men xuống 20 - 30%, tăng độ xốp 5 - 8%, tăng thể tích bánh lên men 15 - 25% màu sắc vỏ bánh đẹp hơn, ruột bánh xốp và sáng màu hơn tăng hương vị thơm ngon của bánh. Khi làm bánh mì ngọt, nếu thêm chế phẩm enzyme amylase vào bột, sẽ xảy ra quá trình thủy phân bột thành đường, do đó giảm lượng đường tiêu tốn cho sản xuất.
1.4.6.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco
Từ lâu các sản phẩm mật tinh bột như: mật gluco, mật malto… được sản xuất bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng axit hay bằng malt. Ngày nay người ta sử dụng rộng rãi chế phẩm enzyme amylase vi sinh vật trong sản xuất mật tinh bột, gluco, malto từ nguyên liệu tinh bột.
Ở các nước tiên tiến khác, phương pháp dùng enzyme từ vi sinh vật trong lĩnh vực này cũng đã được áp dụng có hiệu quả và phổ biến, hay phối hợp phương pháp axit và enzyme. Trong sản xuất mật tinh bột, gluco, hai enzyme chủ yếu là amylase và glucoamylase từ nấm mốc và vi khuẩn.
Enzyme α-amylase để dịch hóa tinh bột và tạo malto, còn glucoamylase dùng
để đường hóa tạo gluco, chế phẩm amylase cho sản xuất gluco được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus sublitis, Bacillus mesentericus. Chế phẩm glucoamylase thường sản xuất từ nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Rhizopus delamar, Mucor… hay từ một số nấm men Saccharomyces,
Endomycopsis…
1.4.6.4. Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác
Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác như bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp, nước ép trái cây, tương … Chế phẩm enzyme amylase giúp cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường, làm trong các thành phần dạng lỏng, dễ cô đặc, tăng lượng đường trong sản phẩm, giảm lượng đường tiêu tốn, tăng lượng đường đơn giản dễ hấp thu cho người, đặc biệt là thức ăn cho trẻ em, giảm thời gian nấu, chế biến …
Hiện nay người ta dùng hỗn hợp các enzyme: protease, amylase, pectinase trong sản xuất các sản phẩm trên, tạo sản phẩm dễ tan, dễ tiêu hóa màu sắc đẹp, dễ lọc, dễ cô đặc, rút ngắn thời gian sản xuất, giảm giá thành sản phẩm…
1.4.6.5. Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy
Trong công nghiệp dệt, chế phẩm enzyme amylase của vi khuẩn
Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus diastaticus, Bacillus amylosolvens… có tính ưu việt chịu nhiệt cao, dùng trong rũ hồ vải, tạo điều kiện tốt dễ dàng khi nhuộm, tẩy vải sau này. Ngoài ra người ta còn dùng chế
1.4.6.6. Trong chăn nuôi
Chế phẩm enzyme amylase được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp với các enzyme khác như: protease, cenlulase, pectinase … để sản xuất các loại thức
ăn dễ tiêu hóa, hấp thu trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Sử dụng thức ăn có chế phẩm enzyme amylase sẽ làm tăng khả năng hấp thu, tiêu hóa do đó giảm lượng thức ăn, tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinh sản, chống bệnh tật…
1.4.6.7. Trong y học
Enzyme amylase cùng các enzyme khác, được dùng cho chữa bệnh do thiếu enzyme, kém khả năng chuyển hóa chất, bệnh về tiêu hóa, tim, thần kinh … Ngoài ra chế phẩm enzyme amylase dùng để điều chế môi trường nuôi vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU:
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đối tượng nghiên cứu là các chủng nấm mốc phân lập từ các mẫu bánh men cơm rượu ở các địa điểm khác nhau theo bảng 2.1:
Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu STT Kí hiệu mẫu Nơi lấy mẫu
1 HA Chợ Hóa An – Biên Hòa – Đồng Nai 2 TĐ Chợ Từ Đức – Quận ThủĐức – TP.HCM 3 Q9 Chợ Phước Long – Quận 9 – TP.HCM 4 Q5 Chợ Kim Biên – Quận 5 – TP.HCM
5 LBT Chợ Long Bình Tân – Biên Hòa – Đồng Nai 6 BH Chợ Biên Hòa – Biên Hòa – Đồng Nai 7 BL Chợ Bửu Long – Biên Hòa – Đồng Nai 8 BD Chợ Tân Ba – Tân Uyên – Bình Dương
2.1.2. Vật liệu và hóa chất:
2.1.2.1 Dụng cụ và thiết bị:
- Các dụng cụ thí nghiệm phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh như: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, erlen …
- Tủ cấy - Tủấm
- Nồi hấp
- Máy ly tâm Centrifuge 5430 - Máy sấy
- Máy đo OD Beckman Coulter - Máy lắc điều nhiệt 2.1.2.2. Hóa chất: a. Thuốc thử Lugol • I2 : 1 g • KI : 2 g • Nước cất :300 ml b. Dung dịch đệm axetat pH 4,7: • Axetat : 82 g • Axit CH3COOH : 32,3 ml • Nước cất : 1000 ml c. Dung dịch tinh bột 1%: • Tinh bột : 1 g • Dung dịch đệm axetat : 10ml • Nước cất : 100 ml
2.1.2.3. Môi trường:
a. Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)
Khoai tây 200g Glucose 20g
Agar 20g
Nước cất 1000ml pH=6.5
b. Môi trường thạch – tinh bột
KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.2g (NH4)2SO4 0.2g Tinh bột tan 10g Agar 20g Nước cất 1000ml 2.2. PHƯƠNG PHÁP:
2.2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu:
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường Trường Đại học Lạc Hồng.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.2.1. Phương pháp phân lập:
Môi trường phân lập nấm mốc được sử dụng là môi trường PGA. Các chủng nấm mốc được phân lập từ các mẫu bánh men cơm rượu. Bánh men
được bẻ làm đôi, lấy một ít bánh men ở giữa rải đều lên bề mặt đĩa petri chứa môi trường PGA, sau đó đem để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau khi nấm mốc mọc trên bề mặt môi trường của đĩa petri. Dùng que cấy chuyển nấm mốc qua đĩa petri có chứa môi trường PGA mới để làm thuần. Nấm mốc sau khi làm thuần được cấy vào ống nghiệm và được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C
để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái nấm mốc: a. Quan sát khuẩn lạc nấm mốc: a. Quan sát khuẩn lạc nấm mốc:
Cấy chủng nấm mốc lên môi trường PGA, đểở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau đó quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc nấm mốc trên đĩa như: màu sắc, hình dạng sợi nấm và đo kích thước khuẩn lạc.
b. Quan sát tế bào nấm mốc dưới kính hiển vi:
Làm tiêu bản tế bào nấm mốc trong xanh methylen, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học.
2.2.2.3. Phương pháp xác định khả năng phân giải tinh bột:
Môi trường sử dụng để xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc là môi trường thạch – tinh bột. Cấy chủng nấm mốc lên môi trường thạch - tinh bột, để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau đó, đổ dung dịch Lugol lên môi trường thạch - tinh bột. Nếu có vòng phân giải xung (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
quanh khuẩn lạc thì chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột, nếu không có vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm mốc không có khả năng phân giải tinh bột, dùng thước đo vòng phân giải tinh bột và ghi nhận kết quả.
2.2.2.4 Phương pháp thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc [6]
Thu nhận chế phẩm enzyme amylase theo phương pháp nuôi cấy chìm:
Hình 2.1: Quy trình thu nhận enzym amylase từ nấm mốc 100 ml MT PGA lỏng Giống nấm mốc Lắc 200v/p trong 48 giờ ở t0 phòng Thu dịch lỏng, bỏ cặn Ly tâm 6000v/p trong 5 phút Tủa bằng cồn 960 lạnh
Giữ lạnh ở 40C trong 24 giờ
Ly tâm ở 6000v/p trong 20 phút Thu cặn, bỏ dịch Sấy dưới 400C Enzyme bán tinh khiết
Chuẩn bị 100ml môi trường trong erlen 250ml. Đem tiệt trùng ở 1210C