3. ðỐ IT ƯỢNG, NGUYấN LI ỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. IT ƯỢNG, ðỊ Að IỂM, THỜI GIAN NGHIấN CỨU
Cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập từ lợn sau cai sữa (45 - 90 ngày tuổi) bị tiờu chảy nuụi tại cỏc hộ gia ủỡnh và cỏc trang trại chăn nuụi trờn
ủịa bàn ngoại thành Hà Nội.
3.1.2. địa ủiểm nghiờn cứu
- địa bàn nghiờn cứu: Cỏc trang trại và hộ gia ủỡnh chăn nuụi tại một số huyện ngoại thành Hà Nội. - địa ủiểm xột nghiệm: Phũng thớ nghiệm Bộ mụn Vi trựng Ờ Viện Thỳ Y Quốc gia. 3.1.3. Thời gian thực hiện ủề tài Từ thỏng 10 năm 2007 ủến thỏng 8 năm 2008. 3.2. NỘI DUNG NGHIấN CỨU - Phõn lập và xỏc ủịnh một sốủặc tớnh sinh học của cỏc chủng E. coli phõn lập ủược từ phõn và phủ tạng của lợn mắc tiờu chảy
- Xỏc ủịnh số lượng vi khuẩn E. coli cú trong phõn của lợn tiờu chảy và lợn khỏe mạnh
- Xỏc ủịnh một số yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E. coli
phõn lập ủược
- Xỏc ủịnh tớnh mẫn cảm với khỏng sinh của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược
- Xỏc ủịnh ủộc lực của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược trờn chuột bạch
- Thử nghiệm một số phỏc ủồủiều trị lợn sau cai sữa bị tiờu chảy
3.3. NGUYấN LIỆU DÙNG TRONG NGHIấN CỨU 3.3.1. Mẫu bệnh phẩm 3.3.1. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm là phủ tạng gồm: gan, lỏch, hạch màng treo ruột, hạch dưới hàm, chất chứa ruột non của lợn sau cai sữa mắc tiờu chảy.
- Phõn lợn bị tiờu chảy tại cỏc cơ sở chăn nuụi ở ngoại thành Hà Nội.
3.3.2. Mụi trường, húa chất, dụng cụ, ủộng vật thớ nghiệm
- Cỏc loại mụi trường, húa chất dựng trong nuụi cấy, phõn lập và giỏm ủịnh ủặc tớnh sinh vật húa học của vi khuẩn E. coli phõn lập ủược bao gồm: Thạch mỏu, thạch MacConkey, nước thịt BHI, nước thịt thường, nước thịt pepton và cỏc loại mụi trường ủường Glucose, Lactose, Mannitol.. do hóng Oxoid của Anh sản xuất.
- Cỏc loại giấy tẩm khỏng sinh của hóng Oxoid (Anh) sản xuất. - Khỏng huyết thanh chuẩn của Úc dựng ủịnh typ vi khuẩn E. coli
phõn lập ủược.
- Cỏc húa chất và dụng cụ phũng thớ nghiệm khỏc dựng trong nghiờn cứu vi khuẩn.
- động vật thớ nghiệm: chuột nhắt trắng khỏe mạnh cú trọng lượng 18- 20 gram/con.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
Trong ủề tài này, chỳng tụi sử dụng cỏc phương phỏp nghiờn cứu, kỹ
thuật xột nghiệm theo tiờu chuẩn phũng thớ nghiệm của Bộ mụn Vi trựng, Viện Thỳ Y Quốc gia.
3.4.1. Thu thập mẫu và phõn lập vi khuẩn
3.4.1.1. Thu thập mẫu
- Mẫu phõn phõn lập vi khuẩn: Dựng tăm bụng vụ trựng ngoỏy sõu vào trực tràng lợn mắc tiờu chảy và chưa dựng thuốc (khỏng sinh) ủiều trị. Khi toàn bộ tăm bụng thấm ướt phõn lợn, lấy ra, cho ngay vào typ, vặn chặt, ghi ký hiệu mẫu.
- Mẫu phõn ủể ủếm số lượng vi khuẩn: lấy khoảng 2-3g phõn từ hậu mụn của cỏc lợn mắc tiờu chảy vào 1 tỳi nilon sạch, ghi ký hiệu mẫu
- Mẫu bệnh phẩm gồm: lỏch, gan, chất chứa ruột non của lợn tiờu chảy - Tất cả cỏc mẫu, sau khi lấy ủều ủược bảo quản trong ủiều kiện lạnh 4oC theo quy trỡnh bảo quản mẫu của Bộ mụn Vi trựng, Viện thỳ Y và ủược vận chuyển ngay ủến phũng thớ nghiệm ủể tiến hành cỏc xột nghiệm tiếp theo.
3.4.1.2. Phõn lập và giỏm ủịnh vi khuẩn
Cỏc phương phỏp nuụi cấy và giỏm ủịnh vi khuẩn ủược thực hiện theo quy trỡnh nghiờn cứu thường quy của Bộ mụn Vi trựng, Viện Thỳ Y Quốc gia.
Sơủồ 2.1: Quy trỡnh phõn lập vi khuẩn ủường ruột (Bộ mụn Vi trựng- Viện Thỳ y Quốc gia) Oxidase õm tớnh Thạch mỏu Thạch MacConkey Thạch mỏu yếm khớ E. coli K. pneumoniae Enterobacter aerogenes Salmonella Edwardsiella Proteus Thạch DHL Thạch BG Nước thịt PBW Thạch DHL Thạch BG 37oC/24- 48h/hiếu khớ 37 oC/24- 48h/hiếu khớ Salmonella R/Y/H2S+ Mọc trờn thạch MacConkey Trực khuẩn Gram õm KL ủen trờn DHL KL ủỏ trờn BG Enterobacteriaceae TSI Dung huyết Trực khuẩn Gram dương 37oC/24-48h/ yếm khớ C. perfringens Lờn men
ủường Lờn men ủường
Lờn men ủường Lờn men ủường Mẫu (phủ tạng, phõn, chất chứa) Lactose + Lactose -
3.4.2. Xỏc ủịnh số lượng vi khuẩn E. coli trong 1 g phõn của lợn tiờu chảy hoặc bỡnh thường chảy hoặc bỡnh thường
Mẫu là 1g phõn của lợn bị tiờu chảy hoặc bỡnh thường, ủược pha loóng trong dung dịch PBS thành cỏc nồng ủộ 10-1, 10-2, Ầ, 10-8. Lấy 0,1 ml dung dịch ở cỏc nồng ủộ ủó pha loóng 10-6, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn ủều trờn bề mặt thạch MacConkey và thạch yếm khớ. Bồi dưỡng ở 37oC trong
ủiều kiện hiếu khớ hoặc yếm khớ trong vũng 24 giờ. Mỗi nồng ủộ pha loóng dựng 3 ủĩa thạch. đếm số khuẩn lạc E. coli mọc trờn ủĩa thạch, rồi tớnh trung bỡnh cho mỗi nồng ủộ.
Số lượng vi khuẩn ủược tớnh theo cụng thức: X = 10 x a x b
Trong ủú: X: là tổng số lượng vi khuẩn cú trong 1 g phõn hoặc chất chứa a: là số lượng vi khuẩn trung bỡnh của nồng ủộ pha loóng thớch hợp ủược chọn
b: là hệ số pha loóng mẫu Hệ số 10: vỡ cấy 0,1 ml
3.4.3. Xỏc ủịnh serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng vi khuẩn E. coli
phõn lập ủược bằng phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh
Vi khuẩn E. coli cú nhiều serotyp O khỏc nhau, do vậy, bước quan trọng ủầu tiờn là xỏc ủịnh ủược nhúm serotyp O, sau ủú tiến hành cỏc phản
ứng ngưng kết với cỏc khỏng huyết thanh ủơn giỏ trong nhúm cần xỏc ủịnh. Những nguyờn liệu cơ bản cho việc xỏc ủịnh serotyp gồm:
+ Cỏc chủng E. coli cần ủịnh typ ủược giữ trờn thạch mỏu + Cỏc khỏng huyết thanh O chuẩn (ủa giỏ và ủơn giỏ)
* Phương phỏp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh như sau:
Nhỏ lờn 2 ủầu lam kớnh sạch, mỗi ủầu một giọt nước muối sinh lý, dựng que cấy vụ trựng lấy khuẩn lạc E. coli cần xỏc ủịnh trờn mụi trường thạch mỏu trộn ủều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt khỏng huyết thanh chuẩn vào một bờn huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bờn huyễn dịch cũn lại (đối chứng). Nếu cú phản ứng ngưng kết sẽ xuất hiện sau 1 phỳt.
+ Phản ứng dương tớnh khi hỡnh thành ngưng kết giữa khỏng nguyờn là vi khuẩn với khỏng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tỏch ra làm 2 phần là cỏc hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rừ rệt thỡ ủược ủỏnh giỏ mức ++++. Tuỳ theo khả năng ngưng kết ủể cú thểủỏnh giỏ mức ngưng kết ở cỏc mức
ủộ khỏc nhau +, ++, +++.
+ Phản ứng là õm tớnh khi hỗn dịch vi khuẩn với khỏng huyết thanh
ủục ủều như bờn ủối chứng.
Với những chủng cú ngưng kết với khỏng huyết thanh nhúm, tiếp tục thực hiện như vậy với cỏc khỏng huyết thanh ủơn giỏ thuộc nhúm ủể xỏc
ủịnh rừ từng serotyp. Trong trường hợp cỏc chủng cú hiện tượng ngưng kết chộo với nhiều nhúm hoặc ngưng kết với nhiều ủơn giỏ khỏc nhau, thỡ phải pha loóng khỏng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số
pha loóng cao nhất.
3.4.4. Phương phỏp xỏc ủịnh cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập ủược khuẩn E. coli phõn lập ủược
3.4.4.1. Xỏc ủịnh khả năng dung huyết
Vi khuẩn E. coli phõn lập ủược cấy trực tiếp lờn mụi trường thạch mỏu cừu, bồi dưỡng ở 37oC/24 giờ. Căn cứ vào mức ủộ dung huyết ủểủỏnh giỏ kiểu dung huyết:
- Dung huyết α là dạng dung huyết mờ, khụng hoàn toàn - Dung huyết β là dạng dung huyết trong hoàn toàn - Khụng dung huyết hay dung huyết γ
3.4.4.2. Xỏc ủịnh cỏc yếu tố gõy bệnh (ủộc tố và yếu tố bỏm dớnh) của vi khuẩn: bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
* Cỏch tiến hành:
- DNA mẫu là khuẩn lạc vi khuẩn E. coli mọc trờn mụi trường thạch mỏu ở 37oC/24h.
- Hỗn hợp phản ứng PCR: gồm
Primers: 1 àl mỗi loại
Dung dịch ủệm (5X): 5.0 àl
Enzyme (Taq polymerase): 0.05 àl
Nước khử ion vừa ủủ ủể ủạt ủược thể tớch cuối cựng là 25 àl cho 1 phản ứng.
- Chu trỡnh của phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và ủược thực hiện trong mỏy nhõn gen tự ủộng Perkin Elmer, theo sơủồ sau:
Chu trỡnh
thứ nhất 30 chu trỡnh tiếp theo Chu trỡnh cuối Loại yếu tố gõy bệnh cần xỏc ủịnh Biến tớnh (oC/phỳt) Biến tớnh (oC/phỳt) Gắn mồi (oC/phỳt) Tổng hợp (oC/phỳt) Tổng hợp (oC/phỳt) STa, STb, LT, F4 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 VT2e, F18 94/5 94/1 50/1 72/1 72/7
- Chạy ủiện di: Sản phẩm PCR thu ủược sau chu trỡnh phản ứng ủược nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR ủược chạy ủiện di trờn thạch agarose 2%
trong dung dịch ủệm TAE (Tris - acetate - EDTA) với hiệu ủiện thế 100V trong vũng 40 phỳt. đõy là cỏch ủể cho cỏc ủoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương phỏp này dựa trờn nguyờn lý là cỏc phõn tử acid nucleic trong mụi trường pH trung tớnh thỡ tớch ủiện õm nhờ cỏc nhúm phosphat nằm trờn khung phosphodiester của cỏc sợi nucleic. Khi ủặt chỳng vào ủiện trường, cỏc phõn tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phõn tớch trờn thạch agarose, cỏc phõn tử acid nucleic tựy theo kớch thước sẽ
chuyển dịch với tốc ủộ khỏc nhau: loại phõn tử cú kớch thước lớn chạy chậm, loại cú kớch thước bộ chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm:Gel thạch sau khi chạy ủiện di ủược nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1 àl/ml) trong vũng 15 phỳt. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phõn tử của nú chui vào liờn kết giữa cỏc bazơ. Vị trớ cốủịnh của cỏc nhúm cú khoảng cỏch gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với cỏc phõn tử
BEt tự do.
- đọc kết quả: bằng cỏch quan sỏt dưới ỏnh ủốn UV (300 ηm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trờn ảnh chụp nền ủen, cỏc ủoạn axit nucleic hiện lờn ở dạng băng màu trắng và cú thể chụp ảnh ủược và ghi nhận lại. Kớch thước cỏc băng DNA ủược so sỏnh với DNA chuẩn (DNA marker) ủược cho vào cựng lỳc với sản phẩm PCR ở một giếng riờng biệt, cạnh cỏc giếng dựng phỏt hiện cỏc sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dõy chuyền này mà người ta cú thể xỏc ủịnh ủược ủộ dài của ủoạn sản phẩm PCR.
3.4.5. Kiểm tra ủộc lực của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập trờn chuột bạch
để xỏc ủịnh ủộc lực của cỏc vi khuẩn gõy bệnh, cú thể thực hiện bằng phương phỏp tiờm truyền qua ủộng vật thớ nghiệm. Cỏc bước thực hiện như sau:
- Bước 1: Cỏc vi khuẩn thuần từ mụi trường giữ giống ủược cấy chuyển vào mụi trường BHI trong bỡnh tam giỏc 100ml. Canh trựng ủược bồi dưỡng ở 37oC/24 giờ, trong quỏ trỡnh nuụi cú lắc ủảo ủể kớch thớch sự
tăng sinh của vi khuẩn.
- Bước 2: Tiờm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiờn cứu cho 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh (trọng lượng từ 18 - 20 g/con), với liều tiờm là 0,2 ml/chuột vào phỳc xoang. Lụ ủối chứng gồm 2 chuột ủược tiờm dung dịch BHI với liều tiờm và ủường tiờm tương tự.
- Bước 3: Kiểm tra và theo dừi thời gian chết, số lượng chuột chết trong vũng 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bỡnh quõn của mỗi lụ ủể ủỏnh giỏ ủộc lực của vi khuẩn. Mổ khỏm, phõn lập vi khuẩn từ mỏu tim của cỏc chuột chết.
3.4.6. Xỏc ủịnh khả năng mẫn cảm với khỏng sinh của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược khuẩn phõn lập ủược
Khả năng mẫn cảm với khỏng sinh của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập
ủược kiểm tra bằng phương phỏp khuyếch tỏn trờn ủĩa thạch và ủỏnh giỏ kết quả theo Hội ủồng quốc gia Hoa Kỳ về cỏc tiờu chuẩn lõm sàng phũng thớ nghiệm (NCCLS).
* Phương phỏp tiến hành như sau:
- Bước 1: Chuẩn bị mụi trường thạch ủĩa Muller Hinton.
- Bước 2: Cỏc chủng vi khuẩn ủược nuụi cấy trong mụi trường thạch mỏu ở 37oC. Lấy 1 khuẩn lạc, hoà vào 1,5 ml nước sinh lý ủể ủạt ủược ủộ ủục 0,5 trong dóy so màu McFarland. Dựng tăm bụng vụ trựng, tẩm dung dịch ủó pha loóng và dàn ủều lờn thạch ủĩa Muller Hinton.
- Bước 3: Dựng mỏy tựủộng ủặt cỏc khoanh giấy tẩm khỏng sinh của hóng Oxoid (Anh) lờn mặt ủĩa thạch.
- Bước 4: Bồi dưỡng ở 37oC/18 - 24 giờ. đọc kết quả bằng cỏch ủo
ủường kớnh vũng vụ khuẩn và so sỏnh với bảng chuẩn ủểủỏnh giỏ mức ủộ
mẫn cảm hay khỏng khỏng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.
Bảng 3. 1: Tiờu chuẩn ủỏnh giỏ mức ủộ mẫn cảm và khỏng khỏng sinh theo NCCLS (1999) Vũng vụ khuẩn (ủường kớnh mm) Khỏng sinh Khỏng trung bỡnh Mẫn cảm Mẫn cảm Sulphamethoxazole/Trimethoprim (SXT 25) < 10 11 - 15 ≥16 Streptomycin (S 10) < 11 12 - 14 ≥ 15 Gentamicin (CN 30) < 12 13 - 17 ≥ 18 Neomycin (N 30) < 12 13 - 14 ≥ 15 Cephalothin (KF 30) < 14 15 - 17 ≥18 Amikacin (AK30) < 14 15 - 16 ≥17 Apramycin (APR 15) < 10 11 - 14 ≥15 Ceftiofur (EFT 30) < 17 18 - 20 ≥21 Lincospectinomycin (LS 109) < 10 11 - 13 ≥14 Enrofloxacin (ENR 5) < 16 17 - 19 ≥20 Ampicillin (AML 10) < 11 12 - 14 ≥ 15 Tetracycline (TE 30) < 14 15 - 18 ≥ 19
3.4.7. Thử nghiệm một số phỏc ủồủiều trị tiờu chảy cho lợn
Từ kết quả xỏc ủịnh khả năng mẫn cảm khỏng sinh của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược, chỳng tụi ủó tiến hành lựa chọn một số phỏc ủồ ủể ủiều trị thử nghiệm cho cỏc lợn bị tiờu chảy. để ủỏnh giỏ ủược hiệu quả
một cỏch khỏch quan. Cỏc phỏc ủồ ủược thực hiện cú sự ủồng ủều tương
ủối về cỏc tiờu chớ cơ bản sau:
- Số lợn tiờu chảy ở cựng một ủịa phương ủược phõn ra làm 3 lụ tương ứng với 3 phỏc ủồủiều trị bệnh.
- Số lần và ngày ủiều trị bệnh ủược dựng ủồng ủều trong cỏc phỏc ủồ. - đỏnh giỏ hiệu quả của cỏc phỏc ủồ ủiều trị căn cứ vào sựổn ủịnh dần trạng thỏi phõn, tỡnh trạng ăn, uống ... sau 4 - 7 ngày, kể từ khi dựng thuốc.
3.4.8. Phương phỏp xử lý số liệu
Số liệu thu thập ủược xử lý theo phương phỏp nghiờn cứu trong chăn nuụi của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002) [43], sử dụng phần mềm của chương trỡnh Excel. Cỏc tham số cơ bản: - Giỏ trị trung bỡnh : + Trường hợp mẫu < 30: n x X ∑ i = − (với n từ 1 ủến i). + Trường hợp mẫu > 30 : n S K A X i 0 + = − - độ lệch tiờu chuẩn : 1 ) ( 2 − − ổ = ∑ − − n x x x S - Sai số của số trung bỡnh: + Trường hợp mẫu < 30: 1 − ổ = −