4. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬ N
4.2. KẾT QUẢ XÁC ðỊ NH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN E COLI TRONG
PHÂN CỦA LỢN BỊ TIấU CHẢY VÀ LỢN KHỎE MẠNH
Nhiều tỏc giả khi nghiờn cứu về hội chứng tiờu chảy ở lợn cho rằng: loạn khuẩn ủường ruột là nguyờn nhõn gõy ra tiờu chảy ở lợn. Sự biến ủộng về số lượng vi khuẩn cú trong phõn lợn tiờu chảy phản ỏnh hiện tượng loạn khuẩn ủường ruột. để tỡm hiểu về vấn ủề này, chỳng tụi ủó tiến hành xỏc
ủịnh số lượng vi khuẩn E. coli cú trong 1g phõn của 19 lợn mắc tiờu chảy và 14 lợn bỡnh thường ở 2 giai ủoạn 45 - 60 ngày tuổi và 61 - 90 ngày tuổi. Kết quảủược trỡnh bày ở bảng 4.3.
Từ kết quả trỡnh bày ở bảng 4.3 cú thể thấy: số lượng vi khuẩn E. coli cú trong 1 g phõn của lợn bị tiờu chảy cao hơn rất nhiều (xấp xỉ 28 lần) so với lợn khỏe mạnh. Cụ thể như sau:
+ Ở giai ủoạn 45 - 60 ngày tuổi: số lượng vi khuẩn E. coli trung bỡnh trong 1 g phõn của lợn bỡnh thường là 5,18 x 106 vi khuẩn, ủó tăng lờn tới 138,27 x 106 vi khuẩn khi lợn bị mắc tiờu chảy (tăng xấp xỉ 27 lần)
+ Trong khi ủú ở giai ủoạn 61 - 90 ngày tuổi, số lượng vi khuẩn tăng xấp xỉ 29 lần (từ 4,97 x 106 vi khuẩn ở lợn bỡnh thường, tăng lờn ủến 145,19 x 106 ở lợn bị tiờu chảy).
Bảng 4.3: Kết quả xỏc ủịnh số lượng vi khuẩn E. coli trong 1 g phõn của lợn bị tiờu chảy và lợn khỏe mạnh
Số lượng vi khuẩn E. coli trung bỡnh cú trong 1 g phõn (VK/g)
Tuổi của lợn
(Ngày) Lợn tiờu chảy (n=19) Lợn bỡnh thường (n=14)
45 - 60 138,27 x 106 5,18 x 106
61 - 90 145,19 x 106 4,97 x 106
Trung bỡnh 141,73 x 106 5,08 x 106
Kết quả xỏc ủịnh số lượng vi khuẩn cũng phự hợp với kết quả phõn lập vi khuẩn như ủó trỡnh bày ở cỏc bảng 4.1 và 4.2. Kết quả của nghiờn cứu này cũng phự hợp với nghiờn cứu của một số tỏc giả khỏc, ủú là sự
tăng lờn về số lượng của vi khuẩn trong ủường ruột của lợn mắc bệnh tiờu chảy. Tỏc giả Trương Quang (2005) [31], khi kiểm tra số lượng vi khuẩn E. coli trong 1 g phõn ở 314 mẫu phõn của lợn khụng bị tiờu chảy và 312 mẫu phõn của lợn bị tiờu chảy, cho kết quả là số lượng vi khuẩn ở lợn 1- 21 ngày tuổi nhiều gấp 2,46 - 2,73 lần và ở lợn 22 - 60 ngày tuổi gấp 1,88 - 2,10 lần so với lợn khụng bị tiờu chảy.
Cỏc tỏc giả Hồ Soỏi và đinh Thị Bớch Lõn (2005) [33] cũng phõn lập
E. coliở lợn con từ 1 - 60 ngày tuổi nhưng chia thành 2 giai ủoạn phỏt triển khỏc nhau của lợn, cho kết quả là số lượng vi khuẩn E. coli phõn lập ủược từ lợn bị tiờu chảy ở 1 - 45 ngày tuổi là 132,79 x 106/g phõn và ở lợn 40 - 60 ngày tuổi là 124,08 x 106/g phõn, gấp 2,37 lần và 1,39 lần so với lợn khụng bị tiờu chảy.
Từ cỏc dẫn liệu khoa học trờn, kết hợp với kết quả của nghiờn cứu này cho thấy cú sự khỏc nhau về số lượng vi khuẩn E. coli trong 1 gam phõn giữa cỏc lứa tuổi của lợn. điều này cú thểủược giải thớch dựa trờn cơ
sở khỏc nhau về ủặc ủiểm sinh lý trong từng giai ủoạn sinh trưởng của lợn, sự dần hoàn thiện chức năng bộ mỏy tiờu húa cũng như khu hệ sinh vật trong ủường ruột và thời gian tiếp xỳc với ủiều kiện ngoại cảnh. Ngoài ra, thành phần và số lượng vi khuẩn của ủường ruột phụ thuộc vào nhiều yếu tố khỏc nữa như: thể trạng của lợn, tập quỏn chăn nuụi, khẩu phần dinh dưỡng, chất lượng thức ăn..
Ở lợn khỏe mạnh bỡnh thường, số lượng vi khuẩn ủường ruột luụn luụn ở thế cõn bằng ủộng, nhưng khi lợn bị stress làm giảm sức ủề khỏng cơ thể, một số loại vi khuẩn sẽ cú cơ hội phỏt triển tăng nhanh về số lượng làm mất sự cõn bằng ủộng và gõy ra tiờu chảy. Trong thớ nghiệm này, cú thể thấy vi khuẩn E. coli ủó cú sự tăng ủột biến rất lớn về số lượng khi lợn mắc tiờu chảy, và cú thể là quỏ trỡnh phỏt triển, vi khuẩn E. coliủó sản sinh ra chất khỏng khuẩn Colicin V, ức chế sự phỏt triển của cỏc loại vi khuẩn
ủường ruột khỏc và chiếm vị trớ ưu thế trong hệ vi khuẩn ủường ruột. Vấn
ủề này cũng phần nào lý giải cho hiện tượng vỡ sao tỷ lệ phõn lập ủược cỏc loại vi khuẩn khỏc như: Salmonella, Clostridium và một số vi khuẩn ủường ruột khỏc là rất thấp trong cỏc mẫu ủược kiểm tra.
4.3. KẾT QUẢ GIÁM đỊNH đẶC TÍNH SINH HểA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP đƯỢC
Mỗi loại vi khuẩn cú một số ủặc tớnh sinh học riờng biệt như: tớnh chất mọc của vi khuẩn trờn cỏc mụi trường nuụi cấy thụng thường và mụi trường ủặc hiệu, chuyển húa cỏc loại ủường và sản sinh cỏc hợp chất sinh học trung gian trong mụi trường nuụi cấy. Giỏm ủịnh cỏc ủặc tớnh sinh húa
của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược nhằm phõn loại và xỏc ủịnh ủỳng loài, trờn cơ sở ủú cú những nghiờn cứu tiếp theo. Kết quả giỏm ủịnh ủặc tớnh sinh húa của 89 chủng nghi ngờ là vi khuẩn E. coli phõn lập ủược từ
phõn và phủ tạng của cỏc lợn bị tiờu chảy ủược trỡnh bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4: Kết quả xỏc ủịnh ủặc tớnh sinh húa của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược TT Loại phản ứng Số chủng dương tớnh/Tổng số chủng kiểm tra Tỷ lệ (%) 1 Dung huyết 89/89 100.0 2 Indol 89/89 100.0 3 MR 89/89 100.0 4 VP 0/89 0 5 Citrat 0/89 0 6 Inositol 0/89 0 7 Lactose 89/89 100.0 8 Maltose 89/89 100.0 9 Mannitol 89/89 100.0 10 Mannose 89/89 100.0 11 Sorbitol 89/89 100.0 12 Xylose 89/89 100.0
Ảnh 4.3: Hỡnh thỏi vi khuẩn E. coli dưới kớnh hiển vi (x 1000 lần)
Kết quả của bảng 4.4 cho thấy:
- Tất cả cỏc chủng E. coli phõn lập ủược (100%) ủều cú khả năng gõy dung huyết trờn mụi trường thạch cú bổ sung 5% mỏu cừu. Trước ủõy khả năng gõy dung huyết của vi khuẩn E. coli ủược coi là một yếu tố gõy bệnh quan trọng của vi khuẩn này, nhưng nhiều nghiờn cứu gần ủõy ủó thống nhất rằng dung huyết chỉ ủược xem như một ủặc tớnh sinh húa học của vi khuẩn E. coli. Kết quả này là cao hơn so với một số nghiờn cứu của cỏc tỏc giả khỏc như: Bựi Xuõn đồng (2002) [7] khi xỏc ủịnh yếu tố dung huyết của vi khuẩn E. coli phõn lập ủược từ lợn sau cai sữa ở Hải Phũng cho thấy: 69,1% số chủng vi khuẩn E.coli phõn lập ủược gõy dung huyết. Nguyễn Khả Ngự (2000) [21] xỏc ủịnh tỷ lệ gõy dung huyết của cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập ủược từ lợn bị bệnh phự ủầu ở ủồng bằng sụng Cửu Long cho thấy: 60,82% chủng gõy dung huyết. Nguyễn Ngọc Hải và cộng sự (2003) cũng xỏc ủịnh yếu tố gõy dung huyết của 91 chủng E. coli
phõn lập từ mẫu hạch màng treo ruột của lợn tại thành phố Hồ Chớ Minh và thành phố Biờn Hũa cho thấy: 24,5% cỏc chủng E. coli gõy bệnh phự ủầu cú khả năng gõy dung huyết. Như vậy, yếu tốủịa lý và tỡnh hỡnh chăn nuụi cũng ủó ớt nhiều ảnh hưởng tới tỷ lệ cỏc chủng vi khuẩn E. coli cú khả năng gõy dung huyết.
- 100% cỏc chủng E. coli ủược kiểm tra cho phản ứng sinh Indol và MR dương tớnh. Cỏc phản ứng VP và Citrat thỡ ủều cho kết quả õm tớnh. Tỷ
lệ cỏc chủng lờn men ủường Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Sorbitol và Xylose là 100%. Riờng với ủường Inositol, tất cả cỏc chủng ủều cho kết quả õm tớnh.
Tỏc giả Trịnh Quang Tuyờn và cộng sự (2004) [49], khi xỏc ủịnh cỏc
tại trại lợn Tam điệp cho thấy vi khuẩn E. coli cú phản ứng với tất cả 13 loại ủường thử nhưng với tỷ lệ khỏc nhau: 100% số mẫu cú sinh Indol và lờn men ủường Lactose, trờn 90% số chủng lờn men ủường Trehalose, Sorbitol, Arabinose và Mannitol. Với cỏc loại ủường Sucrose, Dulcitol khụng quỏ 50% số chủng lờn men. Với cỏc loại ủường cũn lại số chủng cú khả năng lờn men dao ủộng từ 50% ủến 90%.
Kết quả này hoàn toàn phự hợp với ủặc tớnh gõy sản sinh Indol và lờn men ủường của vi khuẩn E. coli ủó ủược Nguyễn Vĩnh Phước (1978) [30] mụ tả. đõy là một ủặc ủiểm quan trọng ủể phõn biệt vi khuẩn E. coli
với cỏc vi khuẩn khỏc trong tập ủoàn cỏc vi khuẩn của ủường tiờu húa.
4.4. KẾT QUẢ XÁC đỊNH CÁC YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN E. COLI PHÂN LẬP đƯỢC CHỦNG VI KHUẨN E. COLI PHÂN LẬP đƯỢC
Cỏc yếu tố gõy bệnh của 89 chủng E. coli phõn lập ủược, bao gồm: cỏc yếu tố bỏm dớnh F4, F18 và ủộc tố chịu nhiệt STa, STb, ủộc tố khụng chịu nhiệt LT và ủộc tố verotoxin VT2e ủó ủược xỏc ủịnh bằng phản ứng PCR. Kết quảủược trỡnh bày ở bảng 4.5 và biểu ủồ 4.1.
Kết quả cho thấy: cú 72/89 chủng vi khuẩn E. coli (chiếm 80,9%)
ủược kiểm tra cho kết quả dương tớnh với ớt nhất 1 yếu tố gõy bệnh. Cỏc gen quy ủịnh sinh tổng hợp 2 loại khỏng nguyờn bỏm dớnh (F4 và F18) và 2 loại ủộc tố (STb và VT2e) ủều ủó ủược phỏt hiện thấy trong số cỏc chủng E. coli phõn lập ủược. Cụ thể như sau:
+ Trong 2 loại khỏng nguyờn bỏm dớnh, số chủng mang F4 là 16 chủng, chiếm tỷ lệ 17,9%, nhiều hơn gấp 1,5 lần so với chủng mang F18 (11 chủng, 12,4%). Như vậy, Số chủng mang yếu tố bỏm dớnh (27 chủng, chiếm 30,3%), thấp hơn nhiều so với số chủng khụng mang yếu tố bỏm dớnh (62 chủng, chiếm 69,6%).
+ Trong cỏc loại ủộc tố, số chủng mang ủộc tố VT2e chiếm tỷ lệ
cao hơn hẳn (80,9%) so với số chủng mang ủộc tố STb (chỉ chiếm tỷ lệ
10,1%). Tuy nhiờn, 2 loại ủộc tố STa và LT thỡ ủều khụng ủược phỏt hiện thấy trong số cỏc chủng E. coli phõn lập ủược.
Bảng 4.5:Kết quả xỏc ủịnh cỏc yếu tố gõy bệnh cú trong cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập ủược
Số chủng mang cỏc gen quy ủịnh sinh tổng hợp cỏc yếu tố gõy bệnh Cỏc yếu tố gõy bệnh Số chủng dương tớnh/Tổng số chủng kiểm tra Tỷ lệ (%) F4 16/89 17,9 Yếu tố bỏm dớnh F18 11/89 12,4 STa 0/89 0 STb 9/89 10,1 LT 0/89 0 độc tố VT2e 72/89 80,9 Cự Hữu Phỳ và cộng sự (2004) [28] khi nghiờn cứu trờn 84 chủng E. coli cú 38/84 chủng, chiếm 42,5% mang khỏng nguyờn F4 và 14/84 chủng, chiếm 16,7% mang khỏng nguyờn F5 và khụng cú chủng nào mang khỏng nguyờn F6 và F41. Trong số 3 loại ủộc tốủường ruột là STa, STb và LT thỡ số
chủng cú khả năng sản sinh STb chiếm tỷ lệ cao nhất (70/84 chủng), sau ủú
ủến STa (57/84 chủng) và LT (40/84 chủng).
Khi tiến hành một nghiờn cứu tương tự với 85 chủng vi khuẩn E. coli
luận: cú 94,1% số chủng mang khỏng nguyờn bỏm dớnh (F4 hoặc F18) và 5,9% số chủng khụng mang khỏng nguyờn bỏm dớnh. Hiện tượng này xảy ra tại ủịa bàn ngoại thành Hà Nội cú thểủược giải thớch là do việc sử dụng vacxin trong một thời gian dài ủó cú tỏc ủộng làm biến mất một số loại khỏng nguyờn bỏm dớnh trong cỏc chủng vi khuẩn E. coli tại ủịa phương, hoặc chỳng cú thể mang một yếu tố bỏm dớnh khỏc mà trong phạm vi ủề tài này chỳng tụi chưa xỏc ủịnh ủược.
Biểu ủồ 4.1: Tỷ lệ cỏc yếu tố gõy bệnh cú trong cỏc chủng vi khuẩn
E. coli phõn lập ủược 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 F4 F18 STa STb LT VT2e %
Ảnh 4.5: Cỏc sản phẩm của phản ứng PCR phức hợp sau quỏ trỡnh ủiện di.
M: 100 bp DNA marker. Giếng 1, 6, 7: VT2e dương tớnh. Giếng 2, 3, 4, 5: VT2e, F18 dương tớnh.
4.5. TỔ HỢP CÁC YẾU TỐ GÂY BỆNH Cể TRONG CÁC CHỦNG VI KHUẨN E. COLI PHÂN LẬP đƯỢC VI KHUẨN E. COLI PHÂN LẬP đƯỢC
Bảng 4.6 tổng hợp cỏc yếu tố gõy bệnh tồn tại ủồng thời trong cựng 1 chủng vi khuẩn E. coli.
Theo kết quả trỡnh bày ở bảng 4.6: cú 5 kiểu tổ hợp gen của cỏc yếu tố gõy bệnh ủược phỏt hiện thấy trong số cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập ủược từ lợn sau cai sữa bị tiờu chảy nuụi tại ủịa bàn quanh Hà Nội. Trong ủú, số chủng chỉ mang 1 yếu tố gõy bệnh là VT2e chiếm phổ biến nhất (45 chủng, 62,5%) và thuộc về nhúm VTEC. Cỏc tổ hợp F4/VT2e và F18/VT2e cú tỷ lệ bằng nhau (12,5%) và ủều thuộc về nhúm VTEC. Cỏc tổ
hợp cũn lại F4/STb/VT2e và F18/STb/VT2e chiếm cỏc tỷ lệ thấp hơn, lần lượt là 9,7% và 2,8%, thuộc về nhúm ETEC/VTEC.
Bảng 4.6: Tổ hợp cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập ủược Cỏc chủng mang cỏc yếu tố gõy bệnh TT Tổ hợp cỏc yếu tố gõy bệnh Số lượng Tỷ lệ % Phõn loại nhúm E. coli 1 F4/VT2e 9 12,5 VTEC 2 F4/STb/VT2e 7 9,7 ETEC/VTEC 3 F18/VT2e 9 12,5 VTEC 4 F18/STb/VT2e 2 2,8 ETEC/VTEC 5 VT2e 45 62,5 VTEC Tổng cộng 72 100,0
đỗ Ngọc Thỳy và cộng sự (2005) [46], trong một nghiờn cứu tương tự với cỏc chủng E. coli phõn lập ủược từ lợn sau cai sữa bị tiờu chảy ở
cỏc tỉnh miền Bắc ủó thụng bỏo cú 11 tổ hợp gen ủược phỏt hiện. Nguyễn Tất Thành (2007) [42] khi nghiờn cứu với cỏc chủng phõn lập
ủược tại Phỳ Thọ cũng ủó bỏo cỏo cú 7 tổ hợp gen ủược tỡm thấy. Trong
ủú, cỏc chủng chỉ mang 1 yếu tố gõy bệnh là VT2e ủều chiếm tỷ lệ lớn trong cỏc nghiờn cứu này.
4.6. KẾT QUẢ XÁC đỊNH SEROTYP O CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN E. COLI PHÂN LẬP đƯỢC KHUẨN E. COLI PHÂN LẬP đƯỢC
Serotyp O của 72 chủng vi khuẩn E. coli cú mang ớt nhất 1 loại ủộc tố ủó ủược xỏc ủịnh bằng phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh. Kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 4.7 và biểu ủồ 4.2.
Bảng 4.7: Kết quả xỏc ủịnh serotyp O của cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập ủược
Kết quả
Số chủng
kiểm tra Serotyp O Số chủng dương tớnh Tỷ lệ (%)
O138 12 16,7 O139 15 20,8 O141 21 29,2 O147 8 11,1 72 O149 16 22,2 Ghi chỳ: Chỉ cú 72 chủng cú khả năng sản sinh ớt nhất 1 loại ủộc tố mới ủược xỏc ủịnh serotyp
Kết quả bảng 4.7 cho thấy tất cả 72 chủng vi khuẩn E. coliủược kiểm tra ủều cho kết quả dương tớnh với 1 trong 5 serotyp khỏng huyết thanh O. Trong ủú, số chủng thuộc serotyp O141 là 21 chủng, chiếm tỷ lệ cao nhất 29,2%. Cỏc serotyp O149, O139 và O138 lần lượt chiếm cỏc tỷ lệ tương
ứng là 22,2%; 20,8% và 16,7%. Serotyp O147 cú tỷ lệ thấp nhất, chỉ
Biều ủồ 4.2: Tỷ lệ cỏc serotyp O của cỏc chủng vi khuẩn
E. coli phõn lập ủược
Theo tỏc giả Nguyễn Thị Nội (1985) [23], cỏc chủng E. coli phõn lập
ủược từ lợn con theo mẹ bị bệnh phõn trắng chủ yếu thuộc cỏc serotyp O149: K88; O141: K88. Theo Lờ Văn Tạo và cộng sự (1993) [35], trong