b. Các kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu ADN
1.2.1.2ứng dụng CNSH trong nghiên cứu đa dạng di truyền ong mật trên thế giớ
thế giới
Những ứng dụng công nghệ hiện đại trong nghiên cứu sinh học phân tử trên ong nói chung và ong mật nói riêng đ−ợc các nhà khoa học theo cùng với nhịp b−ớc phát triển của CNSH, đi từ kỹ thuật enzyme đến kỹ thuật đọc trình tự ADN. Các nhà khoa học thực hiện nghiên cứu ADN và ARN cả trong nhân đến ngoài nhân. Nh−ng về nghiên cứu di truyền quần thể và đa dạng di truyền, ng−ời ta th−ờng tiến hành trên ty thể.
* Sự lựa chọn ty thể để nghiên cứu sinh học phân tử
Ty thể là cơ quan tử có chức năng chuyển hoá năng l−ợng trong tế bào, nó có cấu trúc ADN hoặc nhiễm sắc thể và rất khác với nhiễm sắc thể trong nhân. Mỗi một ty thể chứa vài cặp nhiễm sắc thể và mỗi một tế bào chứa một cho tới hàng trăm ty thể và là nơi có chứa các enzyme của quá trình hô hấp (Lê Đình L−ơng, 1990[12]; Hoàng Văn Tiến và công sự, 1997[28]; Lafferty P. and Rowe J., 1994[68]). Ty thể đ−ợc chú ý trong nghiên cứu sinh học phân tử là vì:
- Thứ nhất, đặc tính của ty thể động vật là có số l−ợng bản sao ADN cao, trong khi đó ở nhân chỉ có 2 bản sao ADN. Những nơi giàu ADN ty thể là trứng và mô cơ cánh của côn trùng. Vì số l−ợng bản sao chép của gen ty thể cao nên chúng ta dễ ràng tách triết và tinh sạch đủ cho nhiều dạng phân tích trực tiếp từ mô động vật mà không cần thiết phải cloning từ gen đơn lẻ (Smith D. R. et al., 2000)[110].
- Thứ 2, kích th−ớc gen ty thể của động vật nhỏ và phần lớn ở dạng mạch vòng. Nh− ở bọ cạp có khoảng 14000 bp, bọ cánh cứng 32000 bp, ng−ời 16500 bp (Avise J. C., 1994)[31]. Độ lớn của genom ty thể là nhỏ hơn nhiều so với genom nhân.
- Thứ 3 cấu trúc ADN ty thể động vật chứa gen bảo thủ và gen biến đổi. Số l−ợng gen mã hoá cho protein chỉ có 12 hoặc 13 gen, 2 ARN vân chuyển (rRNA) và 22 ARN thông tin (tRNA) (hình 1.1).
Tỷ lệ tiến hoá của một gen hoặc một mẩu của đoạn ADN là nhân tố quan trọng cho nghiên cứu hệ thống học và sinh địa lý. Khi hai dòng gen phân tách nhau ra, mỗi một dòng bắt đầu tích luỹ đột biến của mình một cách độc lập. Trong giai đoạn đầu của quá trình phân tách, sự đột biến ch−a thể xuất hiện tại cặp bazơ. Tuy nhiên, theo thời gian khi đột biến trong mỗi dòng đ−ợc tích luỹ, nó trở nên ngày càng có thể xảy ra đột biến trên đoạn ADN của cặp bazơ.
ở ong mật ADN ty thể chứa khoảng 16500 - 17000 bp (base pair) đã đ−ợc giải mã (Crozier R. H. and Crozier Y. C., 1993)[43]. ADN ty thể là vật chất đặc biệt đ−ợc di truyền theo dòng mẹ có nghĩa là tất cả ong thợ trong đàn của một ong chúa đều đ−ợc nhận phân tử ADN ty thể một cách đồng đều và chính xác từ ong chúa của chúng. Cũng do sự giới hạn bởi di truyền dòng mẹ nên những con ong thợ lại không xảy ra sự trộn lẫn ADN ty thể của nó, chúng chỉ thể hiện hình thức ADN của ong chúa (Hepburn H. R. and Radloff S. E., 1998)[58].
Hình 1.1. Cấu trúc genome của ty thể ong mật Apis mellifera ligustica
ADN ty thể rất hiệu quả cho nghiên cứu phả hệ, di truyền quần thể, hệ thống học và sinh địa lý (Smith D. R., 1991[105]; Hall H. G. and Smith D. R., 1991[56]; Smith D. R., 1992[107]; Cameron S. A., 1993[32]; Cameron S. A. and Mardulyn P., 2001[33]; Smith D. R. and Hagen R. H., 1997[108]; Smith D. R. and Hagen R. H., 1999[109]; Smith D. R. et al., 2000[110]). ADN ty thể đ−ợc quan tâm nh− vậy là vì nó đ−ợc di truyền theo dòng mẹ. Haplotype ADN ty thể của một con ong thợ là đại diện cho cả đàn đó (Sheppard W. S. and Smith D. R., 2000[101]). Trong ADN ty thể ng−ời ta đã phát hiện thấy có một số vùng có kích th−ớc và trình tự bị biến đổi mạnh, trong đó có đoạn không mã hoá (Non-coding) nằm giữa vùng gen COI, tRNA leu và gen COII của ADN ti thể ở các loài ong mật. Đoạn này mang giá trị thông tin quan trọng cho nghiên cứu quần thể của một loài (Smith D. R. et al., 2003[111], 2005[112]).
Từ những phát hiện trên các nhà khoa học nghiên cứu về ong đã sử dụng các kỹ thuật khác nhau vào lĩnh vực nghiên cứu của mình.
- Bằng kỹ thuật enzym cắt hạn chế của một số đoạn ADN ty thể mà cấu trúc quần thể, sự đa dạng di truyền, vùng sinh địa lý của một số loài ong mật đ−ợc xác định (Smith D. R. et al., 1989[103]; Smith D. R. and Brown W. M., 1990[104]; Smith D. R., 1991[105]; Smith D. R., 1992[106]; Hepbern H. R. and Radloff S. E., 1998[58]; Collins A. M. et al., 2000[38]; Palmer M. R. et al., 2000[83]; La Rua P. D. et al., 2001[67]; Schneider S. S. et al., 2004[99]).
- Bằng kỹ thuật PCR và RFLP đã phân biệt đ−ợc những vị trí khác biệt trên đoạn COI và COII của ADN ty thể ở ong lai Phi và ong Châu âu (Hall H. G. and Smith D. R., 1991[56]; Smith D. R., 1992[106]; Francisco F. O. et al., 2001[50];).
- Với kỹ thuật AFLP và TE-AFLP, Smith D. R. et al. (2003)[111] đã tách loài Apis nigrocincta ra khỏi loài Apis cerana.
- Công nghệ microsatellite cho phép xác định đ−ợc tính đa đực của ong chúa, chẳng hạn ong chúa tơ của loài ong ruồi đỏ Apis florea giao phối từ 5 - 14 ong đực từ nhiều đàn khác nhau trong cùng khu vực, ong ruồi đen Apis
andreniformis từ 10 - 20 ong đực, ong khoái có thể từ 19 - 53 ong đực tại
điểm hội tụ d−ới tán cây cao (Moritz R. F. A., 1994[76]; Moritz R. F. A. et al., 1995[77]; Oldroyd B. P. et al., 1995[79]; Oldroyd B. P. et al., 1996[80]; Oldroyd B. P. et al., 1997[81]). Ngoài ra kỹ thuật này còn cho phép nghiên cứu nguồn gốc di truyền (Schneider S. S. et al., 2004[99]).
- Kỹ thuật đọc trình tự: đây là kỹ thuật sử dụng phổ biến hiện nay cho nghiên cứu đa dạng di truyền trong quần thể, sinh địa lý, lịch sử tiến hoá và xác định nguồn gốc ong mật theo phả hệ (Cameron S. A., 1993[32]; Sheppard W. S. and McPheron B. A., 1992[100]). Bằng kỹ thuật này, ng−ời ta tìm thấy trên 50 haplotype của đoạn không mã hoá COI-Leu-COII của ong nội (Smith D. R. et al., 2000)[110]. Thông qua tỷ lệ biến đổi trong cấu trúc ADN của gen ty thể ong nội ng−ời ta cũng xác định đ−ợc rằng vào giữa kỷ Pleistocence (cách đây khoảng 160.000 năm) mực n−ớc biển thấp hơn so với hiện nay là 200 m do đó toàn bộ vùng Đông Nam á (kể cả Sri Lanka, Đài Loan và Nhật Bản) là dải đất liền. Nhờ đó mà ong bản địa nói chung và ong nội nói riêng đã tràn xuống vùng thấp này (gọi là vùng Sundaland). Đến cuối kỷ Pleistocence mực n−ớc biển tăng lên, nh−ng thấp hơn hiện nay là 120 m, các quần thể ong bắt đâu bị cách ly và tạo thành một số dòng di truyền khác nhau (Smith D. R., 1991[105]; Smith D. R. and Hagen R. H., 1999[109]; Smith D. R. et al., 2000[110]). Bằng nghiên cứu cấu trúc trình tự của đoạn không mã hoá (noncoding), Smith D. R. et al., 2000[110] đã xây dựng đ−ợc quần thể ong nội của Sri Lanka có dạng hình cỏ ba lá và ong Đài Loan có dạng chiếc cặp gim cài tóc. Cũng bằng ph−ơng pháp trên mà Takahashi J. I. et al. (2002)[113] đã
xác lập đ−ợc trình tự loài ong mật Apis nigrocincta, Apis nuluensis ở
Philippines và Apis cerana ở Đài loan là rất ngắn so với Apis koschevnikovi và
Apis cerana ở vùng khác. Villafuerte L. S. et al. (2004)[122] dựa trên trình tự
các gen COI, COII, COIII, 12s rRNA; 16s rRNA và ND4 đã xác định đ−ợc một số nhóm di truyền của quần thể ong khoái Apis dorsata tại Philippines.