Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.5.Quy trình khuếch đại vùng ITS 1 5,8 S ITS2 dùng 2 primer ITS4 và ITS
Côn trùng nhiễm nấm
Phân lập, tách đơn bào tử
Nhân sinh khối trong môi trường CZA Thu sợi nấm Ly trích DNA Thực hiện phản ứng PCR Hóa chất: Master mix Primer ITS4 Primer ITS5 DNA khuôn Nước cất Chu kỳ nhiệt: 940C/3 phút 940C/1 phút 560C/30 giây 720C/1 phút 720C/7 phút 30 chu kỳ
Hình 3.1 Quy trình khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 dùng 2 primer ITS4 và ITS5 3.3.6. Bố trí thí nghiệm trong phản ứng PCR
Mục tiêu: Xác định nồng độ primer tối ưu cho master mix để khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2.
Thí nghiệm được bố trí với 3 nghiệm thức:
Nghiệm thức 1: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 5 pmol/ l. Thí nghiệm
được bố trí với 7 nguồn nấm: PUL-Q2-4, SCL-LA-8, BH-BD-11, SCL-LA-6, RN-LA- 10, SCL-LA-5, BH-BD-13 và một đối chứng dương là nguồn PUL2 đã được khẳng định là có thể tạo sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp với 2 primer ITS4 và ITS5.
Nghiệm thức 2: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 3 pmol/ l . Thí nghiệm
được bố trí với 7 nguồn nấm: DP-BD-1, SCL-KG-37, BH-BD-12, SN-PT-9, PUL-BC- 6, BXD-Q9-8, RM-TD-11. Đối chứng dương là nguồn PUL-BC-3 đã được khẳng định là có thể tạo sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp với 2 primer ITS3 và ITS4, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng. Ngoài ra, nấm Corynespora cũng được bố trí chạy chung quy trình PCR để so sánh kích thước đoạn khuếch đại của nấm này so với các nguồn Beauveria bassiana thí nghiệm.
Nghiệm thức 3: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 0,5 pmol/ l. Bố trí thí
nghiệm lần thứ nhất với 6 nguồn: SCL-KG-37, RM-TD-11, SCL-LA-5, SX-DL-9, PUL-BC-4, DTB-5, đối chứng dương là PUL-BC-3, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được tiến hành với nấm Paecilomyces để thử khả năng khuếch đại của 2 primer ITS4 và ITS5 trên nấm này.
Sau khi kiểm tra kết quả và xác định primer đã đạt nồng độ tối ưu, tiếp tục chạy PCR với các nguồn còn lại với nồng độ primer trên.
Chạy PCR lần thứ 2 theo nghiệm thức trên với 7 nguồn: PUL-Q2-4, PUL-BC- 6, BH-BD-11, SCL-LA-8, BH-BD-13, RN-LA-10, DTB-9. Đối chứng dương là PUL2, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được bố trí với 2 nấm Metarhizum và Corynespora.
Chạy PCR lần thứ 3 theo nghiệm thức trên với 6 nguồn: SCL-LA-6, CC-TD-4, SCL-KG-3, BXD-Q9-8, SN-PT-9, BH-BD-12. Đối chứng dương là BXD-Q9-9, đối chứng âm là nước cất hai lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được bố trí với nấm