Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1.1.Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình của GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham). Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ các hóa chất dư thừa cũng như các sản phẩm ký sinh có thể có trong sản phẩm PCR mà quá trình điện di không thể phát hiện được. Quy trình tinh sạch gồm các bước như sau:
Điện di 15 l sản phẩm PCR trên gel tan ở nhiệt độ thấp (low melting agarose). Cân một ependorf 1,5 ml và ghi nhớ khối lượng.
Sử dụng một mũi dao sạch để cắt band chứa đoạn DNA cần tinh sạch từ gel (thao
tác này được tiến hành dưới tia UV trong phòng tối), cắt càng xát band chứa DNA càng tốt, chuyển phần gel chứa DNA vào ependorf đã được cân từ trước, dùng đầu tip sạch cắt phần gel chứa DNA thành nhiều mảnh nhỏ hơn.
Cân ống ependorf chứa sản phẩm PCR, xác định khối lượng của miếng gel.
Thêm 10 l capture buffer cho mỗi 10 g gel (khả năng tối đa của cột dùng cho tinh
sạch là 300 l buffer và 300 mg gel).
Vortex nhẹ và ủ ở 600C cho đến khi agarose tan hoàn toàn, thường khoảng 10 - 15 phút.
Trong quá trình ủ, cho một GFX column vào collection tube.
Sau khi agarose hoàn toàn tan, li tâm 400 vòng/phút trong 10 giây để tập trung mẫu
xuống phần đáy của ependorf.
Chuyển toàn bộ mẫu vào GFX column (chú ý thao tác nhẹ bằng cách cho mẫu chảy
nhẹ theo thành column). Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút.
Li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây.
Lấy GFX column ra, bỏ phần dịch lỏng trong collection tube, cho GFX column vào
collection tube trở lại.
Thêm 500 l wash buffer vào (thêm từ từ theo thành column), li tâm 10000
vòng/phút trong vòng 30 giây.
Lấy GFX column ra khỏi collection tube, chuyển vào một eppendoft 1,5 ml đã
Thêm 15 l elution buffer trực tiếp vào giữa màng lọc trong GFX column. Để ở
nhiệt độ phòng trong 1 phút.
Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA tinh sạch. 3.4.1.2. Định lƣợng DNA tinh sạch
DNA sau khi tinh sạch được định lượng bằng cách chạy điện di sản phẩm tinh sạch cùng với DNA mass và pha loãng tới nồng độ cần thiết (John P. Curran, 2002).
Sản phẩm PCR Lượng 100-200 bp 200-500 bp 500-1000 bp 1000-2000 bp 1-3 ng 3-10 ng 5-20 ng 10-40 ng