Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS 1 5,8 S ITS
Nghiệm thức 1:
Thực hiện phản ứng PCR theo thành phần trình bày ở mục 3.3.3 với nồng độ primer 5 pmol/ l. Kết quả thể hiện ở hình 4.4.
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.4 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 5 pmol/ l
Ghi chú: 1. PUL-Q2-4 2. SCL-LA-8 3. BH-BD-11 4. SCL-LA-6 5. RN-LA-10 6. SCL-LA-5 7. BH-BD-13 8. PUL2 (đối chứng +) Nồng độ agarose: 1 %. Hiệu điện thế: 50 V. Thời gian điện di: 60 phút. Nhận xét:
Qua kết quả ở hình 4.4 cho thấy tất cả 7 nguồn nấm thí nghiệm đều tạo sản phẩm khuếch đại có kích thước 580 bp (nằm gần vị trí band thấp của loading dye khoảng 500 bp) giống với đối chứng dương. Tất cả 8 nguồn nấm khi chạy PCR với nồng độ primer 5 pmol/ l đều có band phụ ở bên dưới band mong muốn. Các band sản phẩm phụ không thể hiện sắc nét như band chính mà hơi nhòe chứng tỏ có một lượng nhỏ hóa chất PCR dư trong phản ứng. Tuy nhiên, ngoại trừ nồng độ primer tất cả các thành phần khác trong master mix đều đã được tối ưu hóa bởi nhà sản xuất nên có thể khẳng định nguyên nhân phản ứng PCR có sản phẩm phụ là do nồng độ primer quá cao.
Nghiệm thức 2:
Thực hiện phản ứng PCR theo thành phần trình bày ở mục 3.3.3 với nồng độ primer 3 pmol/ l. Kết quả thể hiện ở hình 4.5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 3 pmol/ l
Ghi chú: 1. PUL-BC-3 (đối chứng +) 2. DP-BD-1 3. SCL-KG-37 4. BH-BD-12 5. SN-PT-9 6. PUL-BC-6 7. BXD-Q9-8 8. RM-TD-11 9. Corynespora 10. Đối chứng âm Nồng độ agarose: 1 %. Hiệu điện thế: 100 V. Thời gian điện di: 15 phút.
Nhận xét:
Tất cả 7 nguồn nấm thí nghiệm đều có sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp (gần vị trí band thấp của loading dye) giống với đối chứng dương. Nấm Corynespora
cũng cho sản phẩm khuếch đại với kích thước tương tự chứng tỏ 2 primer ITS4 và ITS5 có thể sử dụng để khuếch đại vùng tương ứng trên nấm Corynespora. Tất cả 9 nguồn nấm thí nghiệm đều có sản phẩm phụ tương tự thí nghiệm 1, sản phẩm phụ của đối chứng âm thể hiện rõ hơn sản phẩm phụ của các nấm thí nghiệm. Như vậy nồng độ primer 3 pmol/ l vẫn còn cao.
Nghiệm thức 3:
Thực hiện phản ứng PCR theo thành phần trình bày ở mục 3.3.3 với nồng độ primer 0,5 pmol/ l. Kết quả thể hiện ở hình 4.6, 4.7 và 4.8.
1 2 3 4 M 5 6 7 8 9
Hình 4.6 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/ l
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Hình 4.7 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/ l
21 22 23 24 25 26 27 28 29
Hình 4.8 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/ l
580 bp
580 bp
Ghi chú: 1. SCL-KG-37 2. RM-TD-11 3.SCL-LA-5 4. SX-DL-9 5. PUL-BC-4 6. PUL-BC-3 (đối chứng +) 7. DTB-5 8. Paecilomyces 9. Đối chứng âm M: Ladder (100 bp) 10. PUL-Q2-4 11. PUL-BC-6 12. BH-BD-11 13. SCL-LA-8 14. BH-BD-13 15. RN-LA-10 16. DTB-9 17. PUL2 (đối chứng +) 18. Metarhizium 19. Corynespora 20. Đối chứng âm 21. Đối chứng âm 22. SCL-LA-6 23. CC-TD-4 24. SCL-KG-3 25. BXD-Q9-8 26. SN-PT-9 27. BH-BD-12 28. BXD-Q9-9 (đối chứng +) 29. Rhizoctonia Nồng độ agarose: 1,5 %. Hiệu điện thế: 50 V. Thời gian điện di: 70 phút. Nhận xét:
Ở lần chạy PCR thứ nhất (hình 4.6), tất cả 6 nguồn nấm thí nghiệm đều có sản phẩm khuếch đại là 580 bp giống với đối chứng dương và phù hợp với kết quả chạy của ladder. Sản phẩm khuếch đại ngoài đoạn DNA mong muốn ra hầu như không có band phụ nhòe bên dưới band sản phẩm chính như hai nghiệm thức 1 và 2, ở vị trí đối chứng âm hầu như không có sản phẩm phụ như trong trường hợp nghiệm thức 2. Nấm
Paecilomyces cũng cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 580 bp chứng tỏ không có sự khác biệt về kích thước của vùng được khuếch đại giữa nấm Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces. Như vậy nồng độ primer 0,5 pmol/ l là thích hợp cho phản ứng khuếch đại vùng ITS với 2 primer ITS4 và ITS5.
Ở lần chạy PCR thứ 2 (hình 4.7), tất cả 7 nguồn nấm thí nghiệm đều cho sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp và hầu như không có sản phẩm phụ. Nấm
Metarizium và nấm Corynespora cũng cho sản phẩm khuếch đại với kích thước tương ứng. Ở lần chạy PCR thứ 3 (hình 4.8), kết quả khuếch đại của 6 nguồn còn lại cũng rất tốt, không có sản phẩm phụ. Nấm Rhizoctonia cho sản phẩm khuếch đại có kích thước lớn hơn của nấm Beauveria bassiana.
Như vậy nồng độ primer thích hợp cho việc khuếch đại vùng ITS giữa 2 mồi ITS4 và ITS5 là 0,5 pmol/ l.
Nhận xét chung:
Nồng độ primer cho kết quả khuếch đại tốt nhất khi sử dụng master mix là 0,5 pmol/ l, tuy nhiên trong sản phẩm khuếch đại vẫn còn một lượng nhỏ hóa chất dư và các sản phẩm ký sinh không thể hiện trên gel nên sản phẩm khuếch đại vẫn cần phải tinh sạch trước khi đọc trình tự.
Đã khuếch đại được vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 kích thước khoảng 580 bp của tất cả các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao, với tỷ lệ chết của côn trùng trong điều kiện phòng thí nghiệm là 67 % - 87 % so với các nguồn không được khuếch đại là 50 % - 70 % (Lê Kiều Khánh Vân, 2005).
Tất cả các nguồn nấm Beauveria bassiana phân lập từ những địa phương khác nhau và trên các đối tượng ký chủ khác nhau đều cho sản phẩm khuếch đại có kích thước giống nhau.
Sản phẩm PCR khuếch đại được có thể dùng đọc trình tự trực tiếp làm cơ sở nghiên cứu mối quan hệ giữa vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 với tính độc của các nguồn nấm phân lập từ những địa phương khác nhau và trên các đối tượng ký chủ khác nhau.