Chó thuộc Trung tâm chó nghiệp vụ (TT chó nghiệp vụ) Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội và chó nuôi trong các hộ gia ựình tại Huyện Gia Lâm.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác ựịnh thành phần loài giun tròn chủ yếu ký sinh ở ựường tiêu hóa của chó khu vực huyện Gia Lâm Ờ Hà Nội.
- Xác ựịnh tỷ lệ, cường ựộ nhiễm các loài giun tròn ký sinh ở ựường tiêu hóa của chó qua phương pháp mổ khám.
- Xác ựịnh tỷ lệ, cường ựộ nhiễm giun tròn ký sinh ở ựường tiêu hóa của chó qua phương pháp xét nghiệm phân.
- Xác ựịnh biến ựộng nhiễm một số giun tròn chủ yếu ở ựường tiêu hóa của hó theo các lứa tuổi.
- Xác ựịnh tỷ lệ, cường ựộ nhiễm giun tròn ựường tiêu hóa của chó theo phương thức chăn nuôi.
- Tìm hiểu sự phát dục của trứng và ấu trùng giun ựũa chó trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm.
- Gây nhiễm thực nghiệm ấu trùng giun ựũa vào chó ựể xác ựịnh thời gian hoàn thành vòng ựời và vòng ựời của giun ựũa Toxocara canis.
- Xác ựịnh triệu chứng lâm sàng, bệnh tắch của chó nhiễm giun ựũa
Toxocara canis trong thực nghiệm.
- Thử nghiệm một số thuốc tẩy giun ựũa Toxocara canis
- đề xuất biện pháp phòng trừ giun tròn ựường tiêu hóa của chó trên cơ sở các kết quả nghiên cứu và kế thừa kết quả nghiên cứu của các tác giả khác.
3.5. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 3.5.1. Mẫu nghiên cứu
- Các mẫu chất chứa trong ruột của chó. - Các mẫu phân chó ở mọi lứa tuổi.
3.5.2. Dụng cụ nghiên cứu
- Kắnh hiển vi, kắnh lúp, lam kắnh, lamen
- Buồng ựếm Mc Master, pipet, ống ựong có các mức chia ựộ là 58ml và 60ml. - Cốc nhựa, ựũa thủy tinh, pank kẹp, kéo, phễu lọc, rây lọc, vòng vớt
3.5.3. Hóa chất
- Nước muối NaCl bão hòa
- Hóa chất bảo quản giun tròn là dung dịch Barbagallo ựược pha chế theo công thức: + 30ml Focmon
+7,5 g NaCl tinh khiết +1000 ml nước cất - Thuốc tẩy giun: Mebendazole, Levamisol
3.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.6.1. Phương pháp nghiên cứu
* Lấy mẫu ựiều tra
Lấy mẫu ựiều tra theo công thức dịch tễ học thú y
N = (1,96)2
Trong ựó N: số lượng mẫu lấy d: ựộ lệch chuẩn
P: tỷ lệ ước ựoán nhiễm giun tròn ựường tiêu hóa của chó là 65% (Phạm Sỹ Lăng, 1989), với ựộ chắnh xác mong muốn là 92%, sai số ước lượng là 0,08. Số mẫu cần lấy ựể nghiên cứu là 136 con, làm tròn là 130 con cho cả hai khu vực nghiên cứu là TT chó nghiệp vụ và Thị trấn Trâu Quỳ (TTr. Trâu Quỳ). Trong ựó số chó mổ khám ấn ựịnh là 40 con, số chó kiểm tra phân với 3 lứa tuổi là 90 con: TT chó nghiệp vụ kiểm tra 45 chó, TTr. Trâu Quỳ 45 chó.
* Phương pháp lấy mẫu phân
Mẫu phân lấy theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên ựơn giản. Phân chó ựược lấy vào các buổi sáng, lấy 10 Ờ 20g phân, cho vào túi nilon ựã chuẩn bị sẵn, buộc chặt bằng vòng chun ghi ựầy ựủ các thông tin cần thiết: số thứ tự mẫu, giống chó, lứa tuổi, trọng lượng, tắnh biệt, ựịa ựiểm lấy mẫu. Mẫu phân
p(1 Ờ p) d2
thu thập xong ựưa về phòng thắ nghiệm xử lý ngay trong ngày nếu không phải bảo quản bằng Formalin 1%, ựể nhiệt ựộ 4 Ờ 60C
* Phương pháp mổ khám toàn diện cơ quan tiêu hóa theo K.I. Skrjabin, 1928.
Phương pháp mổ khám này tìm thấy tất cả các loại giun tròn ký sinh ở cơ quan tiêu hóa của chó, từ ựó có thể ựánh giá ựược tỷ lệ nhiễm, mức ựộ nhiễm, bệnh tắch do giun gây ra.
Cách tiến hành: tách riêng từng phần của ống tiêu hóa, buộc lại. Sau ựó mổ khám dọc theo ựường tiêu hóa (Thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già) ựể kiểm tra bệnh tắch, tìm giun tròn ký sinh và ựếm số lượng từng loại giun tròn/ cá thể chó ựể xác ựịnh tỷ lệ và cường ựộ nhiễm.
* Phương pháp xử lý, bảo quản và ựịnh loại giun tròn ký sinh ở chó
Thu thập toàn bộ giun tròn ựường tiêu hóa. Giun ựược làm chết tự nhiên trong nước lã, sau ựó rửa sạch bằng nước cất, bảo quản trong dung dịch Barbagallo gồm (formol nguyên chất 30ml, Nacl tinh khiết 7,5g, nước cất 1000ml). định loại giun tròn ựã thu thập ựược bằng kắnh lúp và kắnh hiển vi, căn cứ vào kắch thước, hình thái, màu sắc, cấu tạo của giun tròn theo khóa phân loại của Skrjabin K.I và Petrov A.M (1963); Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê (1977).
* Xét nghiệm phân bằng phương pháp Fulleborn tìm trứng giun tròn.
+Nguyên lý: dựa vào sự chênh lệch tỷ trọng giữa nước muối bão hòa (d = 1,18 Ờ 1,20) với tỷ trọng trứng giun tròn. Trứng giun tròn có tỷ trọng nhỏ hơn tỷ trọng của nước muối bão hòa nên sẽ nổi lên bề mặt.
Dùng vòng vớt váng bỏ lên trên phiến kắnh và ựem soi kắnh hiển vi vật kắnh 8 sau ựó soi vật kắnh 20.
+Cách tiến hành phương pháp phù nổi Fulleborn:
Lấy khoảng 5 gram phân chó cho vào lọ tiêu bản rồi cho 1 lượng nước muối bão hòa gấp 5 lần thể tắch của phân. Dùng ựũa thủy tinh làm nát phân trong nước muối bão hòa, ựưa qua lưới lọc vào lọ tiêu bản thứ hai, nước lọc dữ lại.
Dùng pipet ựiều chỉnh lượng nước muối bão hòa tới chu vi nhỏ nhất của lọ, ựể yên tĩnh 15 Ờ 20 phút. Dùng vòng vớt vớt nước váng nổi trên bề mặt dung dịch ựưa lên lam kắnh sạch, soi trên kắnh hiển vi tìm trứng giun sán.
Phương pháp này ựơn giản, dễ làm, dụng cụ thắ nghiệm ựơn giản, rẻ tiền mà hiệu quả cao nên ựược áp dụng rộng rãi.
* định loại trứng giun tròn ựường tiêu hóa của chó dựa vào các nguồn tài liệu của Trịnh Văn Thịnh (1963).
* Cường ựộ nhiễm giun qua mổ khám ựược xác ựịnh theo trị số thấp nhất/chó (min) và cao nhất/chó (max).
* Cường ựộ nhiễm trứng giun ựược xác ựịnh bằng số trứng/g phân qua phương pháp Mc Master.
* Xác ựịnh sự thải trứng của giun ựũa T.canis qua phương pháp ựịnh lượng trứng Mc Master.
Mục ựắch: ựánh giá cường ựộ nhiễm trứng giun sán của con vật là nặng hay nhẹ
Cách làm: bình thủy tinh chia tới vạch 60. Cho vào bình 58ml dung dịch NaCl bão hòa hoặc NaOH 0,1N. Dùng panh lấy phân ựối tượng cần xét nghiệm thả từ từ vào bình tới khi dung dịch dâng tới vạch 60 thì dừng lại. Cho vào bình 10 Ờ 20 bi thủy tinh lắc mạnh sau ựó dừng ựột ngột. Dùng pipet hút 0,15 ml bơm vào từng ô trên buồng ựếm (mỗi ô 0,15ml). đếm số trứng cả 2 buồng.
Gọi tổng số trứng cả 2 buồng ựếm là b Tổng số trứng trong 1g phân là B
B=
* Gây nhiễm ấu trùng giun ựũa T.canis cho chó qua phương pháp
thực nghiệm.
* Chúng tôi theo dõi triệu chứng lâm sàng qua quan sát trực tiếp trên chó mắc bệnh giun ựũa qua thực nghiệm. Các thông tin ựược thống kê và phân tắch.
b x 200 2
* đề xuất các các biện pháp phòng bệnh giun tròn ựường tiêu hóa của chó dựa trên kết quả nghiên cứu của ựề tài, ựồng thời có kế thừa các kết quả nghiên cứu của tác giả ựi trước.
3.6.2. Một số kỹ thuật dùng trong nghiên cứu
3.6.2.1. Thu thập trứng giun bằng phương pháp mổ tử cung của giun trưởng thành
Chọn những giun cái trưởng thành giun to, ựuôi thẳng, tìm lỗ sinh dục khoảng 1/2 phần trước thân, lấy ựũa thủy tinh dầm nhẹ trong ựĩa petri tránh dầm mạnh sẽ làm vỡ trứng. Sau ựó cho vào cốc nhựa sạch, ựổ thêm nước vào khoảng 2/3 cốc, khuấy ựều rồi lọc qua phễu sang một cốc khác. để lắng cặn trong 15 Ờ 20 phút, gạn bỏ nước ở phắa trên, giữ lại cặn. Tiếp tục làm như vậy cho ựến khi nước trong, không còn các mảnh cơ thể giun và hết mùi tanh thì giữ lại cặn, ựổ ra ựĩa lồng, kiểm tra dưới kắnh hiển vi và ựếm số lượng trứng.
3.6.2.2. Kỹ thuật nuôi trứng giun ựũa
Sau khi ựã thu thập ựược trứng, ựổ ra các ựĩa lồng có ựường kắnh 10cm. Môi trường nước nuôi là nước máy có trong phòng thắ nghiệm (pH = 7,2). Số lượng trứng có khoảng 500 Ờ 600 trứng/1 ựĩa lồng. Thường xuyên gạn rửa, lắc trứng 2 ngày 1 lần ựể trứng không bị dắnh vào nhau. Hàng ngày soi trứng ựể xác ựịnh thời gian trứng hình thành ấu trùng.
3.6.2.3. Kỹ thuật ựo kắch thước trứng, ấu trùng giun ựũa
để ựo kắch thước của trứng, các dạng ấu trùng của T. canis bằng phương pháp trắc vi thị kắnh thì ấu trùng hoặc trứng trước khi ựo phải ựược ựậy lamen vào phiến kắnh có nhỏ nước nuôi trứng ựể trứng và ấu trùng bất ựộng mà không làm thay ựổi kắch thước, hình thái.
* Cách sử dụng trắc vi thị kắnh ựể ựo kắch thước của trứng và ấu trùng:
Tháo thấu kắnh mắt của vi thị kắnh và ựặt thước ựo thị kắnh vào gờ chân bên trong thị kắnh rồi lại lắp thị kắnh vào trở lại. đặt tiêu bản lên bàn kắnh, ựiều chỉnh tiêu cự cho rõ ựối tượng cần quan sát, xác ựịnh xem có bao nhiêu vạch trên thước ựo tương ứng với chiều dài và chiều rộng của tế bào ở ựộ phóng ựại
này của kắnh hiển vi. để có kết quả tin cậy cần phải ựo kắch thước của 30 tế bào trở lên.
Tuy nhiên không thể dùng các vạch ựo thị kắnh ựể ựo vì các vạch này của thước ựo thị kắnh chỉ ựược nhìn qua thấu kắnh trên thị kắnh, vì vậy cần xác ựịnh giá trị của mỗi vạch trên thước ựo thị kắnh ựối với ựộ phóng ựại này của kắnh hiển vi và tắnh chuyển ra ộm, do ựó ta phải sử dụng thước ựo vật kắnh. Thước ựo vật kắnh là một bản kim loại với một lỗ ở chắnh giữa, trong lỗ chứa một tấm kắnh, trên một tấm kắnh có một thước ựo có chiều dài 1mm, thước này chia ra chắnh xác 100 phần. Như vậy mỗi vạch tương ứng là 0,01mm tương ứng với 10ộm. Ghi kết quả vào bảng.
để xác ựịnh mỗi vạch trên thước ựo thị kắnh, ta ựặt thước ựo thị kắnh vào vị trắ tiêu bản trên bàn kắnh, ựiều chỉnh tiêu cự của hình ảnh thước ựo ở ựộ phóng ựại thấp rồi chuyển thước ựo vật kắnh vào giữa diện nhìn. Sau khi ựã thấy rõ hình ảnh thước ựo vật kắnh ta chuyển sang vật kắnh dùng ựể ựo tế bào. Vừa di chuyển bàn kắnh, vừa xoay thị kắnh ựể ựặt thước ựo sao cho thước ựo thị kắnh và thước ựo vật kắnh trở thành song song hoặc trùng nhau. Sau ựó làm trùng một vạch ựo của thước ựo thị kắnh với một vạch ựo của thước ựo vật kắnh. Tìm ra các vạch trùng nhau tiếp theo. Xác ựịnh xem có bao nhiêu vạch của thước ựo vật kắnh ứng với một vạch của thước ựo thị kắnh và nhân số thu ựược với 10.
Như vậy ta ựã xác ựịnh ựược giá trị của mỗi vạch trên thước ựo thị kắnh bằng ộm ở ựộ phóng ựại ựó của kắnh hiển vi. Theo cách ựo này biết ựược bao nhiêu vạch của thước ựo thị kắnh tương ứng với chiều dài và chiều rộng của vật cần ựo. Ta nhân số vạch ựó với giá trị của mỗi vạch ở thước ựo thị kắnh, sau khi ựo xong ghi kết quả thu ựược vào bảng.
Theo kết quả chúng tôi ựo ựược, chúng tôi tắnh ựược giá trị của mỗi vạch trên thước ựo thị kắnh là 20ộm (ở ựộ phóng ựại 120 lần)
Vắ dụ: ựo chiều dài của ấu trùng giun ựũa chó, ta xoay thị kắnh hoặc tiêu bản sao cho vạch thước ựo thị kắnh trùng với ựầu của ấu trùng và chiều dài của ấu trùng song song với trục chia vạch của thước ựo thị kắnh. Sau ựó xách ựịnh
bao nhiêu vạch của thước ựo thị kắnh ứng với chiều dài của ựầu mút này ựến ựầu mút kia của ấu trùng. Lấy số vạch ựó nhân với chiều dài mỗi vạch vừa xác ựịnh ựược là 20 ộm, ta sẽ tắnh ựược chiều dài của ấu trùng ở ựộ phóng ựại 120 lần.
3.6.3. Bố trắ thắ nghiệm
3.6.3.1. Thắ nghiệm 1: Xác ựịnh thành phần loài giun tròn ký sinh ở ựường tiêu hóa của chó.
- Mổ khám 40 chó tại khu vực Gia Lâm, tìm giun tròn ựường tiêu hóa, bảo quản và ựịnh loại giun
- Chỉ tiêu theo dõi: ựịnh loại giun tròn tới loài
3.6.3.2. Thắ nghiệm 2: Xác ựịnh tỷ lệ, cường ựộ nhiễm giun tròn chủ yếu ký sinh ở ựường tiêu hóa trên chó qua phương pháp mổ khám
- Tiến hành mổ khám chó tại các ựiểm nghiên cứu
- Theo dõi các chỉ tiêu: tỷ lệ nhiễm, cường ựộ nhiễm giun tròn theo loài - Lập bảng phân tắch và nhận xét.
3.6.3.3. Thắ nghiệm 3: Xác ựịnh tỷ lệ, cường ựộ nhiễm các loài giun tròn chủ yếu ký sinh ở ựường tiêu hóa của chó qua kiểm tra phân
- Tiến hành kiểm tra phân chó tại các ựiểm nghiên cứu. - định loại trứng giun.
- Theo dõi các chỉ tiêu: tỷ lệ nhiễm theo giống loài, cường ựộ nhiễm của từng loại giun.
- Lập bảng phân tắch và nhận xét.
3.6.3.4. Thắ nghiệm 4: sự phát triển của trứng giun ựũa trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm
Thắ nghiệm nhằm mục ựắch xác ựịnh thời gian trứng phát triển qua các giai ựoạn ấu trùng A1, A2, A3.
Trứng giun ựũa ựưa vào nuôi trong ựĩa lồng, ựặt trong phòng thắ nghiệm. Hằng ngày ựo nhiệt ựộ trong phòng, lắc ựảo trứng (2 ngày 1 lần),
quan sát hình thái cấu tạo và sự biến ựổi hình thái của trứng giun dưới kắnh hiển vi. Chỉ tiêu theo dõi: hình thái cấu tạo của trứng; kắch thước trứng; hình thái ấu trùng, dạng ấu trùng A1, A2, A3.
3.6.3.5. Thắ nghiệm 5: Xác ựịnh vòng ựời phát triển của giun ựũa chó loài Toxocara canis trên chó ựược gây nhiễm thực nghiệm
Thắ nghiệm 10 chó ựã gây nhiễm trứng giun ựũa T. canis
Những chó này ựược nuôi ở chế ựộ như nhau, hàng ngày ăn thức ăn sạch sẽ ựảm bảo chất lượng và dinh dưỡng, thức ăn chủ yếu là cháo phổi và gan lợnẦựược uống nước ựầy ựủ. Trước khi gây nhiễm tiến hành kiểm tra phân chó, ựể xác ựịnh chắc chắn những chó ựược gây nhiễm là chó sạch. Sau khi gây nhiễm chế ựộ dinh dưỡng và chăm sóc ựối với ựàn chó khôngthay ựổi. Sau khi gây nhiễm 10, 20, 30 ngày, lấy phân chó ựể tìm trứng trong phân
Chỉ tiêu theo dõi
+ Thời gian từ ngày gây nhiễm cho chó tới ngày bắt ựầu phát hiện trứng trong phân chắnh là thời gian hoàn thành vòng ựời của giun ựũa chó.
+ Quy luật thải trứng
+ định lượng mức ựộ trứng trong 1 gam phân bằng phương pháp ựếm trứng Mc Master, theo dõi chó xem bao nhiêu ngày giun ựũa thải trứng một lần. Từ ựó chúng ta có thể xác ựịnh chu kỳ thải trứng và quy luật thải trứng của giun.
3.6.3.6. Thắ nghiệm 6: Xác ựịnh triệu chứng lâm sàng và bệnh lý ựại thể của Toxocara canis gây ra cho chó trong thực nghiệm.
- Quan sát các triệu chứng lâm sàng của chó nhiễm Toxocara canis
trong thực nghiệm.
3.6.3.7. Thắ nghiệm 7: Thử nghiệm hiệu lực của thuốc tẩy levamisol và mebendazole.
Thắ nghiệm này chúng tôi sử dụng chắnh thuốc tẩy levamisol và mebendazole ựể tẩy cho chó: levamisol với liều 8mg/kgP và mebendazole với liều 80mg/kgP bằng cách trộn thuốc vào thức ăn cho chó ăn.
Chọn 10 chó bị nhiễm giun ựũa qua gây nhiễm trong thực nghiệm, không mắc các bệnh khác.
Tiến hành: dùng những miếng phổi, gan lợn ựã luộc chắn; dùng dao rạch miếng gan, phổi ra sau ựó nhét thuốc và cho lần lượt từng con ăn với yêu cầu ựảm bảo chó ăn hết lượng thuốc ựã chuẩn bị.
- Theo dõi các triệu chứng lâm sàng trước và sau tẩy. - đếm xác giun tẩy ra theo phân.
- Mổ khám chó tìm giun sau khi dùng thuốc tẩy.
3.6.3.8. đề xuất biện pháp phòng trừ giun tròn dường tiêu hóa của chó.