Lợn Piétrain RéHal thuần
3.2 địa ựiểm nghiên cứu
- Xắ nghiệp Chăn nuôi đồng Hiệp- Hải Phòng
- Phòng Thắ nghiệm, Bộ môn Di truyền - Giống vật nuôi, Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nộị
3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Áp dụng quy trình tách chiết ADN và xác ựịnh gen halothane * đối tượng nghiên cứu * đối tượng nghiên cứu
395 lợn Piétrain RéHal
* Phương pháp
Bước 1: Áp dụng quy trình tách chiết ADN bằng phenol-chloroform-isoamy
Quy trình tách chiết ADN từ mẫu ựuôi thực thiện dựa theo qui trình của Sambrook và cộng sự (1989) .
- Cắt ựuôi lợn sơ sinh và bảo quản ở nhiệt ựộ -50oC
- Cắt 25mg ựến 35 mg da ựuôi, dùng cối chày sứ giã nhuyễn sau ựó cho vào ống Effendorf 1,5ml. Bổ sung 200 ộl ựệm phá tế bào và 20 ộl proteinase K, trộn ựềụ Ủ trong water-bath ở 56oC trong 12 giờ.
đệm phá tế bào : 100mM NaCl 10nM Tris HCl (pH 8) 25mM EDTA (pH 8) 0,5 % SDS
- Sau khi ủ, bổ sung 300ộl phenol, lắc ựều, li tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch nổi sau khi li tâm, chuyển sang ống effendorp 1,5ml mớị
- Bổ sung 150ộl phenol + 150ộl choloroform : isoamylalc oho (24:1), lắc ựều, li tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch nổi sau khi li tâm, chuyển sang ống effendorp 1,5ml mớị
- Bổ sung 200 ộl choloroform : isoamylalcoho (24:1), lắc ựều, li tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch nổi sau khi li tâm, chuyển sang ống effendorp 1,5ml mớị
- Bổ sung 200ộl isopropanol, ựể 25-30 phút. Li tâm, hút bỏ dịch, thu tủạ - Bổ sung 200ộl ethanol 70%, li tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch, thu tủa (thực hiện 2 lần).
- để 30 phút khô tủạ Sau ựó, bổ sung 200 ộl nước khử ion. Bảo quản mẫu ở -20oC.
Bước 2: Kiểm tra ựộ tinh sạch của ADN
- Phương pháp 1:
đo nồng ựộ DNA bằng máy Spectrophotometer.
Mẫu ựược pha loãng 10 lần và ựo ựộ hấp phụ DNA ở bước sóng 260nm ( D260) và ựộ hấp phụ protein ở bước song 280nm (D280).
Tắnh d = D260/D280. Chọn mẫu có tỷ số d ≥1,70 ựể thực hiện phản ứng PCR.
Công thức tắnh nồng ựộ AND = OD260 x ựộ pha loãng x 50ộg. - Phương pháp 2: Chạy ựiện di mẫu ADN trên gel agarose 1%.
Bước 3: Nhân ADN bằng kỹ thuật PCR
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen halothan theo phương pháp của Nakjima và cộng sự (1996) với cặp mồi ựặc hiệụ
+ Mồi xuôi: 5Ỗ-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA- 3Ỗ + Mồi ngược: 5Ỗ- ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3Ỗ
+ Các thành phần hóa học khác của phản ứng ựược cung cấp bởi hãng Fermentas.
Xác ựịnh thể tắch của các thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản PCR nhân gen Halothene ựối với máy PTC-100TM Programmable Thermal Controller theo chu trình nhiệt như sau
Bước 1. 95oC - 3 phút Bước 2. 94oC - 1 phút Bước 3. 64oC - 1 phút Bước 5. 72oC - 2 phút Bước 6. 72oC - 8 phút Bước 7. 4oC ..
Sản phẩm của phản ứng ựược kiểm tra trên gel agarose 2 %. Mẫu dương tắnh nếu xuất hiện band trên gel ựoạn gen có chiều dài 659 bp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 4: Xác ựịnh kiểu gen halothane
Cắt sản phẩm ADN - PCR (659bp) bằng enzym giới hạn HhaI theo Hughes và cộng sự (1992)[43]. Enzym giới hạn HhaI nhận biết ựiểm ựột biến trên ựoạn ADN tại vị trắ nucleotide 1843.
- Thành phần :
Sản phẩm PCR : 10ộl HhaI: 1,5ộl Buffer : 2ộl H2O : 18ộl - Kiểm tra trên gel agarose 2,5%
Kiểu gen CC: 2 băng 524 và 135 cặp bazơ Kiểu gen CT : 3 băng 659, 524 và 135 cặp bazơ Kiểu gen TT : 1 băng 659 cặp bazơ