3. nội dun g Đối t−ợn g nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu
CAPB-F 5’-CAT TTA TCC AAG CTC CAC C-3’ B
tính, không xuất hiện ng−ng kết thì phản ứng âm tính.
3.4.4.2. Ph−ơng pháp xác định serotyp của vi khuẩn P. multocidabằng phản ứng PCR
Các typ giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocidađ−ợc xác định dựa trên phản ứng PCR phức hợp (Multiplex PCR), tức là sử dụng nhiều loại mồi khác nhau trong cùng một phản ứng, gồm các cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R để xác định serotyp A, CAPB-F và CAPB-R để xác định serotyp B, CAPD-F và CAPD-R để xác định serotyp D. Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm đ−ợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotyp A, B, D
của vi khuẩn P. multocida
Serotyp Ký hiệu
mồi Trình tự mồi
Sản phẩm (bp)
CAPA-F 5’-TGC CAA AAT CGC AGT GAG-3’
A
CAPA-R 5’-TTC CCA TCA TTG TCA GTG-3’ 1044
CAPB-F 5’-CAT TTA TCC AAG CTC CAC C-3’ B B
CAPB-R 5’-GCC CGA GAG TTT CAA TCC-3’ 760
CAPD-F 5’-TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC-3’
D CAPD-R 5’-CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG-3’ 657
Quy trình thực hiện phản ứng PCR nh− sau:
- ADN mẫu của chủng vi khuẩn cần xác định đ−ợc lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn đj đ−ợc nuôi cấy 370C/24h trên môi tr−ờng thạch máu.
- Phản ứng PCR đ−ợc thực hiện với tổng thể tích là 25 àl, bao gồm các thành phần: 1 àl của mỗi loại mồi (3.2 àM/àl), 5 àl PCR buffer 5x [(750 mM Tris-HCl (pH 8.8), 200 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20) (ABgene), 2 mM MgCl2, 200 àM của mỗi loại dNTP], 0.05 àl Taq DNA Polymerase (5 units/àl) (ABgene), n−ớc cất vừa đủ 25 àl.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...37 - Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm các giai đoạn: tiền biến tính ở 940C/3 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính ở 940C/1 phút, ủ bắt cặp mồi ở 550C/1 phút, tổng hợp ở 720C/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 720C/7 phút.
- Sản phẩm của phản ứng PCR đ−ợc điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1xTAE với hiệu điện thế 100V/30 phút, sau đó nhuộm với ethidium bromide trong 15 - 20 phút. Đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000. Các vạch ADN đ−ợc đánh giá bằng cách so sánh với ADN ladder chuẩn và mẫu đối chứng d−ơng.
3.4.4.3 Ph−ơng pháp xác định serotyp của vi khuẩn S. suis bằng phản ứng PCR
Các serotyp 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S. suis th−ờng gặp gây bệnh nhất ở lợn đ−ợc xác định bằng phản ứng Multiplex PCR. Các cặp mồi dùng để xác định các serotyp 1, 2, 7 và 9 của S. suis đ−ợc lựa chọn dựa vào chuỗi gen mj hoá quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps 1J-F và cps 1J-R để xác định serotyp 1, cps 2J-F và cps 2J-R để xác định serotyp 2, cps 7H-F và cps 7H-R để xác định serotyp 7, cps 9H-F và cps 9H-R để xác định serotyp 9. Trình tự các cặp mồi và các sản phẩm t−ơng ứng của chúng đ−ợc trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 Trình tự các cặp mồi dùng để xác định các serotyp 1, 2, 7 và 9
của vi khuẩn Streptococcus suis
Serotyp Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp) 1 cps1J-F cps1J-R 5'-TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T -3'
5'-TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A-3' 637
2 cps2J-F
cps2J-R