3. nội dun g Đối t−ợn g nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu
5'-GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT-3'
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...38 Thành phần của phản ứng Multiplex PCR dùng để xác định serotyp của vi khuẩn S. suis t−ơng tự nh− trong phản ứng dùng để xác định serotyp của vi khuẩn P. multocida. Chu kỳ nhiệt của phản ứng gồm: tiền biến tính ở 940C/5 phút và 35 chu kỳ nhiệt (biến tính ở 940C/1 phút, ủ bắt cặp mồi ở 530C/1 phút, tổng hợp ở 720C/90 giây), và kéo dài cuối cùng ở 720C/7 phút.
3.4.5 Ph−ơng pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc
Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis phân lập đ−ợc trên chuột bạch theo ph−ơng pháp của Sawada (1985).
Sử dụng canh trùng đ−ợc nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ của mỗi chủng vi khuẩn cần kiểm tra tiêm vào phúc xoang cho 2 chuột bạch, liều tiêm 0,5 ml/chuột. Theo dõi chuột trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số l−ợng chuột chết, thời gian giết chết chuột để đánh giá độc lực của vi khuẩn. Những chuột chết đ−ợc mổ khám quan sát bệnh tích, lấy máu tim để phân lập lại vi khuẩn.
3.4.6 Ph−ơng pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc
Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocidavà S. suis phân lập đ−ợc theo ph−ơng pháp của Bauer (1966).
Chủng vi khuẩn cần kiểm tra đ−ợc cấy vào môi tr−ờng n−ớc thịt BHI, để tủ ấm 370C trong 24 giờ. Dùng tăm bông vô trùng, thấm vào canh trùng rồi đem ria đều trên bề mặt thạch máu. Để cho mặt đĩa thạch khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, rồi tiến hành đặt các khoanh giấy có tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch. Đọc kết quả sau khi nuôi ở 37oC sau 18-24 giờ bằng cách đo đ−ờng kính vòng vô khuẩn (mm) và đối chiếu với bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của các vi khuẩn với các loại kháng sinh nh− ở bảng 3.3.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...39
Bảng 3.3. Tiờu chuẩn ủỏnh giỏ mức ủộ mẫn cảm và khỏng khỏng sinh theo NCCLS (1999) Vũng vụ khuẩn (ủường kớnh mm) Khỏng sinh Khỏng Mẫn cảm trung bỡnh Mẫn cảm Trimethoprim-Sulphamethoxazole < 10 11 - 15 ≥16 Streptomycin < 11 12 - 14 ≥ 15 Gentamicin < 12 13 - 17 ≥ 18 Neomycin < 12 13 - 14 ≥ 15 Cephalothin (KF 30) < 14 15 - 17 ≥18 Amikacin (AK30) < 14 15 - 16 ≥17 Apramycin (APR 15) < 10 11 - 14 ≥15 Ceftiofur (EFT 30) < 17 18 - 20 ≥21 Lincospectinomycin < 10 11 - 13 ≥14 Enrofloxacin (Batril) < 16 17 - 19 ≥20 Ampicillin < 11 12 - 14 ≥ 15 Tetracyclin < 14 15 - 18 ≥ 19 3.4.7 Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu đ−ợc trong quá trình thực hiện đề tài đ−ợc xử lý theo ph−ơng pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...40