4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P. multocida, A. pleuropneumoniae và S.
suis từ lợn nghi mắc PRRS
Với mục đích tìm hiểu nhằm xác định vai trò gây bệnh viêm phổi kế phát của 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trong hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS). Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm gồm máu tim, gan, lách, phổi … của những lợn ốm hoặc chết nghi mắc bệnh PRRS nuôi tại 3 tỉnh Bắc Giang, H−ng Yên và Thái Nguyên.
Sau khi xử lý và nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên các loại môi tr−ờng thông th−ờng và chọn lọc dùng để phân lập vi khuẩn, dựa vào tính chất mọc và hình thái khuẩn lạc, kết hợp với kiểm tra hình thái vi khuẩn và đặc tính bắt màu Gram, tiến hành nhận biết và phân loại vi khuẩn. Kết quả phân lập 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis từ những lợn nghi mắc PRRS tại các địa ph−ơng đ−ợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida
và S. suis từ lợn nghi mắc PRRS
Kết quả phân lập vi khuẩn
A.pleuropneumoniae P.multocida S.suis
Địa ph−ơng Số mẫu D−ơng tính Tỷ lệ (%) D−ơng tính Tỷ lệ (%) D−ơng tính Tỷ lệ (%) Bắc Giang 60 3 5,00 5 8,33 23 38,33 H−ng Yên 57 2 3,51 6 10,53 25 43,86 Thái Nguyên 85 6 7,06 8 9,41 31 36,47 Tổng 202 11 5,45 19 9,41 79 39,11
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...41 Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy, với tổng số 202 mẫu bệnh phẩm thu thập đ−ợc từ những lợn nghi mắc PRRS nuôi tại 3 tỉnh Bắc Giang, H−ng Yên và Thái Nguyên, tỷ lệ phân lập đ−ợc vi khuẩn S. suis là cao nhất với 39,11%, sau đó là tỷ lệ phân lập P. mutocida với 9,41% và cuối cùng là tỷ lệ phân lập A. pleuropneumoniae với 5,45%. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Bắc Giang H−ng Yên Thái Nguyên
Địa ph−ơ ng T ỷ l ệ p h â n l ậ p ( % ) A. pleuropneumoniae P. multocida S. suis
Biểu đồ 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida
và S. suis từ lợn nghi mắc PRRS
Tỷ lệ phân lập 3 loại vi khuẩn có sự khác nhau giữa các địa ph−ơng lấy mẫu. Trong đó, tỷ lệ phân lập đ−ợc S. suis cao nhất ở các mẫu lấy từ H−ng Yên với tỷ lệ 43,86% (25/57 mẫu), tiếp đến là Bắc Giang với tỷ lệ 38,33% (23/60 mẫu) và thấp nhất là ở các mẫu lấy từ Thái Nguyên với tỷ lệ 36,47% (31/85 mẫu). H−ng Yên cũng là tỉnh có số mẫu phân lập đ−ợc vi khuẩn P. multocida cao nhất với 6/57 mẫu (chiếm tỷ lệ 10,53%), sau đó là Thái Nguyên với 8/85 mẫu (9,41%) và Bắc Giang với 5/60 mẫu (8,33%) phân lập đ−ợc vi khuẩn này. Trong khi đó, tỷ lệ phân lập đ−ợc vi khuẩn A. pleuropneumoniae
cao nhất ở Thái Nguyên với tỷ lệ 7,06% (6/85 mẫu), sau đó lần l−ợt là Bắc Giang với tỷ lệ 5,0% (3/60 mẫu) và H−ng Yên với tỷ lệ 3,51% (2/57 mẫu). Nhìn chung ở cả 3 địa ph−ơng lấy mẫu, tỷ lệ phân lập đ−ợc vi khuẩn S. suis là
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...42 cao nhất, sau đó đến tỷ lệ phân lập P. multocida và A. pleuropneumoniae.
4.2 Kết quả kiểm tra các mẫu d−ơng tính với PRRS đồng thời phân lập
đ−ợc ít nhất 1 trong 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.
multocida và S. suis
Sau khi có kết quả phân lập 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis, chúng tôi tiến hành đối chiếu với kết quả xét nghiệm vi rút PRRS để kiểm tra xem có sự trùng hợp về kết quả xét nghiệm mầm bệnh giữa các mẫu bệnh phẩm hay không. Kết quả đối chiếu đ−ợc trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả phân lập đ−ợc 1 trong 3 vi khuẩn A. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis trong các mẫu d−ơng tính với PRRS
Mẫu phân lập vi khuẩn Địa ph−ơng Mẫu d−ơng
tính với PRRS D−ơng tính Tỷ lệ (%)
Bắc Giang 38 29 76,32
H−ng Yên 39 31 79,49
Thái Nguyên 52 43 82,69
Tổng số 129 103 79,84
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy có sự trùng lặp khá cao giữa các mẫu d−ơng tính với PRRS và mẫu phân lập đ−ợc ít nhất 1 trong 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocidavà S. suis. Trong số 129 mẫu d−ơng tính với PRRS đem đối chiếu thì có đến 103 mẫu phân lập đ−ợc ít nhất 1 trong 3 loại vi khuẩn này, chiếm tỷ lệ 79,84%.
So sánh kết quả giữa các địa ph−ơng lấy mẫu cũng cho thấy có sự trùng lặp khá cao, với sự khác nhau không đáng kể. Tỷ lệ mẫu trùng lặp cao nhất là ở Thái Nguyên với tỷ lệ 82,69% (43 trong 52 mẫu d−ơng tính với PRRS phân lập đ−ợc 1 trong 3 loại vi khuẩn này), tiếp đến là các mẫu ở H−ng Yên với tỷ lệ trùng lặp 79,49% (31/39 mẫu) và Bắc Giang là 76,32% (29/38 mẫu).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...43 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis với bệnh PRRS ở lợn tại các địa ph−ơng lấy mẫu. Tuy nhiên, để có thể xác định đ−ợc chính xác vai trò của 3 loại vi khuẩn này thì cần phải tiến hành các b−ớc nghiên cứu tiếp theo.
4.3 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn A.
pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập đ−ợc.
Chúng tôi có thể xác định đ−ợc các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc là vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis vì chúng tôi đj căn cứ vào đặc tính nuôi cấy, hình thái khuẩn lạc và tính chất mọc của vi khuẩn trên các loại môi tr−ờng nuôi cấy, hình thái vi khuẩn và kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá, lên men đ−ờng của các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc. Kết quả thu đ−ợc trình bày sau đây.
4.3.1 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đ−ợc
Chúng tôi đj tiến hành kiểm tra các đặc tính nuôi cấy, đặc tính sinh hóa và khả năng lên men đ−ờng của 11 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae
mà chúng tôi phân lập đ−ợc. Kết quả thu đ−ợc trình bày ở bảng 4.3. Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy:
- Tất cả 11 chủng vi khuẩn đem kiểm tra đều bắt màu gram âm, hình cầu trực khuẩn, không di động, khuẩn lạc nhỏ, tròn, gọn và gây dung huyết trên môi tr−ờng thạch máu. Trên môi tr−ờng thạch máu và Chocolate có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus, vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn nhỏ nh− giọt s−ơng, mọc sát đ−ờng cấy của Staphylococcus aureus. Vi khuẩn không mọc trên môi tr−ờng thạch Mac Conkey.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...44
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của các chủng
vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đ−ợc
Các chủng
A.pleuropneumoniae phân lập đ−ợc (n=11)
Đặc tính
Tiêu chuẩn sinh hóa của A.pleuropneumoniae Số chủng d−ơng tính Tỷ lệ (%) Gram - 0 0,0 Di động - 0 0,0 Dung huyết + 11 100,0 MacConkey - 0 0,0 Indol - 0 0,0 Oxydase + 11 100,0 Catalase + 11 100,0 Glucose + 11 100,0 Mannitol - 0 0,0 Dulcitol - 0 0,0 Galactose + 11 100,0 Maltose + 11 0,0 Lactose - 0 0,0 Saccharose + 11 100,0 Fructose + 11 100,0
- Tất cả các chủng vi khuẩn kiểm tra đều cho kết quả d−ơng tính với phản ứng Oxidase và Catalase, nh−ng âm tính với phản ứng Indol.
- 100% các chủng đem kiểm tra có khả năng lên men các đ−ờng: Glucose, Galactose, Maltose, Saccharose, Fructose và không lên men các đ−ờng: Lactose, Mannitol, Dulcitol.
Tất cả các kết quả kiểm tra về đặc tính hình thái, nuôi cấy, đặc tính sinh hóa và khả năng lên men các loại đ−ờng của các chủng vi khuẩn phân lập
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...45 đ−ợc ở trên đều phù hợp với những đặc tính sinh vật hóa học và đặc tính lên men đ−ờng của vi khuẩn A. pleuropneumoniae theo nh− mô tả của Kilian và cs (1978); Bergey’s (1994). Do đó, chúng tôi có thể khẳng định chắc chắn rằng cả 11 chủng vi khuẩn mà chúng tôi phân lập đ−ợc chính là A. Pleuropneumoniae.
4.3.2 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập đ−ợc
Tiến hành kiểm tra các đặc tính nuôi cấy, đặc tính sinh hóa và khả năng lên men đ−ờng của 19 chủng vi khuẩn P. multocida phân lập đ−ợc chúng tôi thu đ−ợc kết quả trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập đ−ợc
Các chủng P. multocida phân lập đ−ợc (n=19)
Đặc tính Tiêu chuẩn sinh hóa của
P. multocida Số chủng d−ơng tính Tỷ lệ (%) Gram - 0 0,0 Di động - 0 0,0 Dung huyết - 0 0,0 MacConkey - 0 0,0 Indol + 19 100,0 Oxydase + 19 100,0 Catalase + 19 100,0 Glucose + 19 100,0 Mannitol + 19 100,0 Dulcitol - 0 0,0 Galactose + 19 100,0 Maltose - 0 0,00 Lactose - 0 0,00 Saccharose + 19 100,0 Fructose + 19 100,0
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...46 Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy:
- Tất cả 19 chủng vi khuẩn đều có hình thái dạng cầu trực khuẩn, nhỏ, ngắn, hình trứng, đứng riêng rẽ, đôi khi có ghép đôi, bắt màu gram âm. Trên môi tr−ờng thạch máu khuẩn lạc dạng S có mùi tanh đặc tr−ng, không gây dung huyết. Vi khuẩn không mọc trên môi tr−ờng thạch MacConkey.
- 100% số chủng đều cho phản ứng Indol d−ơng tính, phản ứng Catalase, Oxydase d−ơng tính.
- Cả 19 chủng đều lên men các đ−ờng Glucose, Galactose, Mannitol, Saccharose và không lên men các đ−ờng: Lactose, Maltose, Dulcitol.
Tổng hợp các kết quả thu đ−ợc của các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc ở trên đều phù hợp với những đặc tính sinh vật hóa học và đặc tính lên men đ−ờng của vi khuẩn P. multocida nh− các tài liệu đj công bố của Carter (1984), Bergey’s (1994) . Do đó, chúng tôi có thể khẳng định rằng 19 chủng vi khuẩn mà chúng tôi phân lập đ−ợc đem kiểm tra các đặc tính sinh hóa chính là các chủng vi khuẩn P. multocida.
4.3.3 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập đ−ợc.
Chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra các đặc tính nuôi cấy, đặc tính sinh hóa và khả năng lên men đ−ờng của 79 chủng vi khuẩn S. suis phân lập đ−ợc. Kết quả thu đ−ợc trình bày ở bảng 4.5.
Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy:
- Tất cả 79 chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc đều mọc tốt trên môi tr−ờng thạch máu, khuẩn lạc tròn, nhỏ, trắng trong, hơi lồi và gây dung huyết. D−ới kính hiển vi cho thấy vi khuẩn th−ờng có dạng hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, dàn đều, xếp thành chuỗi nh− chuỗi hạt, có độ dài ngắn khác nhau, có thể đứng thành từng cặp hoặc xếp thành chuỗi ngắn từ 3- 5 vi khuẩn. Vi khuẩn bắt màu Gram d−ơng, không di động. Phết kính canh trùng nuôi cấy vi khuẩn từ môi tr−ờng BHI đ−ợc bổ xung 5% huyết thanh ngựa, để tủ ấm 37oC trong
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...47 24 giờ, kiểm tra thấy vi khuẩn có dạng liên cầu rất rõ (10- 14 vi khuẩn). Vi khuẩn không mọc trên môi tr−ờng MacConkey và môi tr−ờng n−ớc muối NaCl 6,5%.
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập đ−ợc
Các chủng S. suis phân lập đ−ợc (n = 79)
Đặc tính Tiêu chuẩn sinh hóa của S. suis
Số chủng d−ơng tính Tỷ lệ (%) Gram + 79 100,0 Di động - 0 0,0 Dung huyết + 79 100,0 MacConkey - 0 0,0 NaCl 6,5% - 0 0,0 Oxydase - 0 0,0 Catalase - 0 0,0 Indol - 0 0,0 VP - 0 0,0 Glucose + 79 100,0 Mannitol - 0 0,0 Sorbitol - 0 0,0 Galactose + 79 100,0 Maltose + 79 100,0 Lactose + 79 100,0 Innulin + 76 96,2 Salicin + 79 100,0 Mannit - 0 0,0
- 100% các chủng đều âm tính với phản ứng Indol, Catalase, Oxidase, VP.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...48 - Tất cả các chủng đều lên men các đ−ờng Glucose, Galactose, Maltose, Lactose, Salicin. 96,2% số chủng lên men đ−ờng Innulin. 100% số chủng thử không lên men các đ−ờng Mannitol, Sorbitol, mannit.
Các kết quả kiểm tra các đặc tính hình thái, nuôi cấy, đặc tính sinh hóa và lên men đ−ờng của các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc đều phù hợp với các đặc tính của vi khuẩn S. suis nh− các tài liệu trong và ngoài n−ớc đj mô tả. Do đó, có thể khẳng định rằng cả 79 chủng vi khuẩn mà chúng tôi phân lập đ−ợc đều là vi khuẩn S. suis.
4.4. Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn A.
pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập đ−ợc.
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định serotyp của các chủng vi khuẩn
A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập đ−ợc để xác định xem chúng thuộc những serotyp nào, có th−ờng gặp gây bệnh ở lợn hay không. Các kết quả thu đ−ợc nh− sau:
4.4.1 Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae và P. multocida phân lập đ−ợc.
Chúng tôi tiến hành định typ huyết thanh học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đ−ợc dựa vào kháng huyết thanh chuẩn của Nhật Bản và úc. Còn với các chủng vi khuẩn P. multocida, chúng tôi sử dụng phản ứng MultiplexPCR để xác định các typ giáp mô A, B, D của các chủng P. multocida phân lập đ−ợc theo quy trình đj đ−ợc chuẩn hóa của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y (Đỗ Ngọc Thúy và cs, 2007).
Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae
và P. multocida phân lập đ−ợc trình bày ở bảng 4.6. Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy:
- Trong số 11 chủng A. pleuropneumoniae phân lập đ−ợc thì có đến 7 chủng thuộc serovar 2 (chiếm tỷ lệ 63,64%), có 3 chủng thuộc serovar 5 (chiếm tỷ lệ 27,27%), còn lại 1 chủng thuộc serovar 1 (chiếm tỷ lệ 9,09%). Nh− vậy, các
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...49 chủng A. pleuropneumoniae mà chúng tôi phân lập đ−ợc đều thuộc các serovar 1, 2 và 5, trong đó phần lớn thuộc serovar 2 và 5, nên có thể thấy vai trò của chúng rất lớn với bệnh viêm phổi của lợn, đặc biệt là serovar 2.
Bảng 4.6. Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn
A. pleuropneumoniae và P. multocida phân lập đ−ợc
Vi khuẩn Số chủng kiểm tra Ph−ơng pháp định typ Kết quả
Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Serovar 1 1 9,09 Serovar 2 7 63,64 A. pleuropneumoniae 11 Ng−ng kết Serovar 5 3 27,27 Typ A 15 78,95 P. multocida 19 PCR Typ D 4 21,05 Kết quả xác định serotyp của chúng tôi khá t−ơng đồng với kết quả thu đ−ợc của Trịnh Quang Hiệp (2004), Cù Hữu Phú và cs (2005). Các tác giả cho biết cũng xác định đ−ợc các vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đ−ợc ở một số trại lợn ở n−ớc ta thuộc các serovar 1, 2 và 5, tuy nhiên theo hai nhóm tác giả này thì tỷ lệ serovar 5 cao hơn so với serovar 2, không giống với kết quả chúng tôi thu đ−ợc.
Theo Desrosiers và cs (1984), Brandreth và Smith (1985): Bệnh viêm phổi truyền nhiễm của lợn có phân bố rộng rji. Nó ngày càng trở nên quan trọng do việc chăn nuôi lợn ngày một phát triển. Bệnh có mặt và lan truyền ở hầu hết các n−ớc châu Âu và một phần ở Mỹ, Canada, Mexico, Nam Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc và úc. Mặc dù chỉ một vài serovar là thịnh hành trên những n−ớc nhất định, nh− serovar 2 ở Thụy Điển, Đức và Thụy Sĩ và serovar 1 và 5 ở Mỹ và Canada nh−ng cũng có thể thấy một số serovar ở cùng một n−ớc. Một số serovar đ−ợc coi là ít độc (ví dụ nh− serovar 3 có độc lực rất thấp) và về dịch tễ chúng không quan trọng ở một số n−ớc nh−ng lại có thể gây nên dịch ở một số n−ớc khác.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...50
- Trong khi đó, với 19 chủng P. multocida phân lập đ−ợc đem định type cho thấy các chủng P. multocida mà chúng tôi phân lập đ−ợc đều thuộc về các typ A và D. Trong đó, phần lớn các chủng thuộc type A với 15/19 chủng (chiếm tỷ lệ 78,95%), với sản phẩm PCR là 1044 bp. 4 chủng còn lại thuộc type D (chiếm tỷ lệ 21,05%), với sản phẩm PCR là 657 bp.
Kết quả thu đ−ợc của chúng tôi khá t−ơng đồng với kết quả thu đ−ợc