2.3.1. Lịch sử phỏt triển của kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch
Hoỏ mụ miễn dịch (immunohistochemistry-IHC) là kỹ thuật khụng thể
thiếu trong cỏc phũng thớ nghiệm với mục ủớch chẩn ủoỏn và nghiờn cứu. Qua cỏc thập kỷ, việc cú thể phỏt hiện ra khỏng nguyờn trong mặt cắt mụ ủó ủược cải thiện nhanh chúng, bằng cỏch lợi dụng ảnh hưởng cú hại của Formol lờn sự phục hồi khỏng nguyờn và tăng tớnh nhạy cảm của hệ thống nhận diện khỏng nguyờn. Hennings và cs (1996)[63] dựng kỹ thuật khỏng thể huỳnh quang trong việc phỏt hiện khỏng nguyờn tế bào trong mặt cắt mụ ủó mở ủầu cho kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch. Từ ủú, hoỏ mụ miễn dịch trở thành cụng cụ
cú giỏ trị trong chẩn ủoỏn và nghiờn cứu cơ chế lõy nhiễm và hỡnh thành bệnh của một số bệnh ở cỏc loài ủộng vật. Cỏc khỏi niệm cơ bản liờn quan ủến hoỏ mụ miễn dịch là sự biểu hiện khỏng nguyờn ở trong mặt cắt cỏc mụ bởi cỏc khỏng thể ủặc trưng. Sự kết hợp giữa khỏng nguyờn và khỏng thể thể hiện bằng phản ứng màu mụ hoỏ học, cú thể phỏt hiện ủược bởi phản ứng phỏt sỏng vi thể hoặc phản ứng huỳnh quang cho ra màu nõu vàng. Mặc dự nguyờn lý của phản ứng ủơn giản nhưng phương phỏp hoỏ mụ miễn dịch ủó trở nờn phức tạp hơn bởi tớnh chặt chẽ, ủộ nhạy và ủặc trưng của phản ứng. Hoỏ mụ miễn dịch ủược thiết lập như một phương phỏp ủỏng tin cậy và chớnh xỏc cho cả hoạt ủộng chẩn ủoỏn và nghiờn cứu thuốc thỳ y.
Trong những năm gần ủõy, húa mụ miễn dịch ủược sử dụng trong cỏc phũng xột nghiệm giải phẫu bệnh như là một phương phỏp nhuộm ủặc biệt, giỳp chẩn ủoỏn phõn biệt bệnh và xỏc ủịnh tỏc nhõn gõy nhiễm khuẩn. Kỹ
thuật này cho phộp quan sỏt ủược sự hiện diện của khỏng nguyờn trờn lỏt cắt mụ. Như vậy, cỏc nhà bệnh học cú thể quan sỏt và ủỏnh giỏ ủược cả hai phương diện hỡnh thỏi học và loại hỡnh miễn dịch trờn mụ hay tế bào. Kỹ thuật này cú thể ủược thực hiện trờn khối nến và quan sỏt ủược dưới kớnh hiển vi quang học thụng thường, khụng cần phải dựng mẫu mụ tươi cũng như kớnh hiển vi huỳnh quang.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 29
2.3.2. Nội dung của kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch
Hoỏ mụ miễn dịch là một xột nghiệm kỹ thuật cao, sử dụng cỏc khỏng thểủó biết ủể phỏt hiện cỏc khỏng nguyờn ủặc hiệu tương ứng cú trong tế bào và mụ. Nếu cú khỏng nguyờn ủặc hiệu sẽ xảy ra phản ứng tạo phức hợp khỏng nguyờn - khỏng thể, cú thể phỏt hiện ủược bằng kớnh hiển vi.
Húa mụ miễn dịch là sự kết hợp giữa hai ngành mụ bệnh học (Histopathology) và miễn dịch học (Immunology). Kỹ thuật này ủược dựng khụng những chỉ ủể xỏc ủịnh một mụ cú hoặc khụng cú khỏng nguyờn ủặc hiệu, mà cũn ủể xỏc ủịnh tỡnh trạng khỏng nguyờn của những tế bào ủặc hiệu trong mụ và vị trớ của khỏng nguyờn trong tế bào. Nhờ ủú cú thể xỏc ủịnh dũng tế bào, xỏc ủịnh rừ tớnh chất sinh học của quần thể tế bào trong cựng một dũng, và chức năng khỏc nhau của cỏc loại tế bào, thậm chớ cũn cú thể xỏc
ủịnh cỏc tỏc nhõn gõy bệnh như vi khuẩn và virus. Chỡa khoỏ chớnh trong hoỏ mụ miễn dịch là phản ứng ủặc hiệu của khỏng thể với khỏng nguyờn. Mặc dự
ủược ỏp dụng rộng rói với nhiều nguyờn lý khỏc nhau trong nhiều lĩnh vực khỏc nhau, nhưng trong giải phẫu bệnh ngoại khoa, hoỏ mụ miễn dịch cú tỏc dụng rất lớn và sõu sắc trong việc chẩn ủoỏn giải phẫu bệnh.
Giải phẫu bệnh ngoại khoa vốn là một ngành cú tớnh chất chủ quan cố
hữu. Mặc dự ủó cú nhiều tiờu chuẩn mụ bệnh học "cơ bản" dựng cho chẩn
ủoỏn, song trong thực tế, sự trựng lặp và giống nhau của cỏc thương tổn, cũng như cú nhiều thương tổn khụng ủiển hỡnh làm cho việc chẩn ủoỏn mụ bệnh học gặp nhiều khú khăn, khú ủi ủến chẩn ủoỏn xỏc ủịnh hoặc khú thống nhất giữa cỏc nhà giải phẫu bệnh với nhau. Vỡ thế ủó từ lõu cỏc nhà giải phẫu bệnh trờn thế giới ủó tỡm nhiều phương phỏp giỳp chẩn ủoỏn phõn biệt như mụ hoỏ học (histochemistry), mụ-enzym học (histoenzymology), miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence), hoỏ mụ miễn dịch, lai tại chỗ (hybridization in stitu)... Hoỏ mụ miễn dịch là một kỹ thuật hiện ủại, mới ủược ỏp dụng tương ủối rộng rói ở những nước tiờn tiến vỡ ủộ chớnh xỏc của phương phỏp này cao, nhưng cú nhược ủiểm là khỏ ủắt tiền nờn cỏc nước nghốo khú cú ủiều kiện ỏp dụng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 30
Húa mụ miễn dịch là kết hợp phản ứng miễn dịch và hoỏ chất ủể làm hiện rừ cỏc khỏng nguyờn hiện diện trong mụ (bào tương, màng tế bào, nhõn). Vỡ khỏng nguyờn khụng thể quan sỏt hỡnh thỏi ủược nờn người ta phải xỏc ủịnh vị trớ của nú trờn tế bào bằng cỏc phản ứng miễn dịch và húa học. Cú hai kỹ
thuật: miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch men.
* Nguyờn lý của phản ứng:
Cho khỏng thể ủặc hiệu lờn mụ, nếu trong mụ cú khỏng nguyờn sẽ cú phản ứng kết hợp khỏng nguyờn-khỏng thể. Cú hai cỏch ủể quan sỏt ủược phức hợp này:
+ Miễn dịch huỳnh quang: cho gắn với một khỏng khỏng thể ủó nhộm chất phỏt huỳnh quang và quan sỏt dưới kớnh hiển vi huỳnh quang.
+ Miễn dịch men: cho khỏng khỏng thểủó gắn enzym (peroxidase hoặc alkaline phosphatase) gắn với chất màu (chromogen), cú thể quan sỏt dưới kớnh hiển vi quang học.
* Hệ thống nhận biết:
Vỡ phức hợp khỏng nguyờn - khỏng thể khụng thể phỏt hiện ủược dưới kớnh hiển vi quang học nờn cần một hệ thống ủể hiển thị vị trớ cú phản ứng khỏng nguyờn-khỏng thể. Hệ thống này gồm 2 phần: (1) khỏng thể thứ hai hay khỏng thể bắt màu và (2) hệ thống phúng ủại dấu hiệu nhận biết.
Khỏng thể thứ hai là cầu nối khỏng thể thứ nhất với hệ thống phúng ủại dấu hiệu nhận biết, ủú là khỏng thể chống globulin miễn dịch (Ig) của khỏng thể thứ nhất. Thớ dụ, nếu khỏng thể thứ nhất là IgG của chuột, thỡ khỏng thể
thứ hai là của thỏ hay dờ chống IgG chuột). Trong phức hợp Avidin-Biotin và phương phỏp Streptavidin khỏng thể thứ hai ủược gắn biotin. Hệ thống phúng
ủại dấu hiệu nhận biết gồm một men (enzyme), chất nền (subtrate) và chất màu (chromogen). Men phải ủược gắn với khỏng thể thứ hai bằng một phản
ứng khỏng nguyờn-khỏng thể hay bằng cầu nối húa học (avidin và biotin). Cần thờm vào một chất nền thớch hợp với men và cuối cựng là chất màu ủược
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 31
gắn lờn ủể cú thể thấy ủược sản phẩm, cho phộp xỏc ủịnh sự hiện diện của khỏng nguyờn trong mụ dưới kớnh hiển vi quang học (Yunus M, 1989) [100].
2.3.3. Ứng dụng của hoỏ mụ miễn dịch trong chẩn ủoỏn giải phẫu bệnh
Hoỏ mụ miễn dịch là phương phỏp ủược sử dụng rộng rói trờn thế giới trong việc chẩn ủoỏn cỏc bờnh do virus và vi khuẩn gõy ra. Hiờn nay ở Việt Nam, kỹ thuật này ủang ủược cỏc viện và cỏc trung tõm chẩn ủoỏn sử dụng
ủể chẩn ủoỏn cỏc bệnh như: dịch tả lợn, Newcastle, tụ huyết trựng. Hội chứng rối loạn sinh sản và hụ hấp…..
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 32
PHẦN III
ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIấN CỨU
3.1. ðỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU
Nghiờn cứu trờn gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi.
3.2. THỜI GIAN VÀ ðỊA ðIỂM NGHIấN CỨU
- Thời gian thực tập: từ 07/2008 – 10/2009 - ðịa ủiểm nghiờn cứu:
+ Phũng thớ nghiệm bộ mụn Bệnh lý - Khoa Thỳ Y - Trường ðại học Miyazaki Nhật Bản.
+ Phũng thớ nghiệm bộ mụn Bệnh lý - Khoa Thỳ y - Trường ðại học Nụng nghiệp Hà nội.
3.3.NGUYấN LIỆU, DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT
3.3.1. Nguyờn liệu
- Gà mắc bệnh Newcastle từ 20 - 22 tuần tuổi ủược thu thập từ cỏc trại thuộc xó Thụy Lõm, Vĩnh Ngọc (ðụng Anh – Hà Nội) và Huyện Tam Dương (Vĩnh Phỳc).
- Gà gõy nhiễm bệnh Newcastle từ 6-8 tuần tuổi.
- Cỏc bệnh phẩm của gà nghi mắc bệnh Newcastle ở mọi lứa tuổi bao gồm: mớ mắt, thực quản, tim, ruột, gan, phổi, nóo...
- Khỏng thể 1: khỏng thể khỏng Newcastle chuẩn (DaKo Envision) - Khỏng thể 2: khỏng khỏng thể 1ủó gắn enzym (DaKo Envision)
3.3.2. Dụng cụ, hoỏ chất
ðể thực hiện cỏc ủề tài nghiờn cứu, chỳng tụi sử dụng cỏc dụng cụ và hoỏ chất như sau:
* Dụng cụ: tủ lạnh, tủ sấy, tủấm, mỏy ủỳc block, mỏy cắt microtom, kớnh hiển vi quang học, ủũa thuỷ tinh, ống nghiệm, lam kớnh, lamen, dao, bộ cốc, lọ ủựng hoỏ chất và một số dụng cụ khỏc cú liờn quan.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 33
* Hoỏ chất:
- Nước cất, cồn Etylic, cồn Methylic, axit Clohydric, parafin, xylen, focmol 10%, dung dịch ủệm PBS (photphat buffer salin), hoỏ chất phỏt màu DAB (3,3 Diamino benzidine tetrahydrochloride), H2O2 (hydro peroxyt)…
- Thuốc nhuộm: Eosin, Haematoxylin. + Eosin: nhuộm bào tương tế bào.
+ Haematoxylin: nhuộm nhõn tế bào. - PBS và cỏc hoỏ chất khỏc.
3.4.NỘI DUNG NGHIấN CỨU
- Xỏc ủịnh cỏc triệu chứng lõm sàng, cỏc bệnh tớch ủại thể chủ yếu ở
gà mắc bệnh Newcastle.
- Nghiờn cứu biến ủổi bệnh lý vi thể một số cơ quan, tổ chức của gà bị bệnh bằng phương phỏp nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) và kỹ thuật húa mụ miễn dịch (Immunohistochemistry: IHC).
- Cỏc chỉ tiờu huyết học của gà bị bệnh Newcastle.
- Xỏc ủịnh mối liờn quan giữa mức ủộ nhiễm virus với sự tổn thương bệnh lý ủại thể và vi thể trờn từng cơ quan.
- So sỏnh hiệu quả chẩn ủoỏn của IHC với cỏc phương phỏp chẩn
ủoỏn khỏc.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.5.1. Phương phỏp quan sỏt, thống kờ sinh học
ðể xỏc ủịnh ủược cỏc triệu chứng lõm sàng chủ yếu của gà mắc Newcastle, chỳng tụi tiến hành quan sỏt, ghi chộp, thống kờ cỏc biểu hiện của gà từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý. ðồng thời dựa vào cỏc ủặc ủiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quỏ trỡnh bệnh xảy ra cũng như thu thập cỏc thụng tin liờn quan. Tiến hành phõn tớch, thống kờ ủể ủưa ra những kết
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 34
quả chớnh xỏc. Xỏc ủịnh chớnh xỏc những triệu chứng lõm sàng chủ yếu cú ý nghĩa vụ cựng quan trọng cho cỏc bước thớ nghiệm tiếp theo.
3.5.2. Phương phỏp mổ khỏm
ðể xỏc ủịnh ủược cỏc biến ủổi ủại thể của cỏc cơ quan, tổ chức của gà mắc bệnh Newcastle cần tiến hành mổ khỏm những gà cú biểu hiện triệu chứng lõm sàng của bệnh. Gà ủược lấy mỏu từ tĩnh mạch. Lột da, lụng và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tỏch cỏc cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sỏt và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu cỏc cơ quan như: phổi, ruột, nóo, mớ mắt, tuyến tụy, manh tràng, tim, gan, lỏch…ngõm trong formol 10% ủể làm tiờu bản vi thể.
3.5.3. Phương phỏp làm tiờu bản vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm cú cỏc biến ủổi ủại thể cần tiến hành làm tiờu bản ủể xỏc ủịnh bệnh tớch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương phỏp làm tiờu bản vi thể theo quy trỡnh tẩm ủỳc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE). Cỏc bước của quỏ trỡnh làm tiờu bản vi thể như sau:
- Chuẩn bị
+ Dụng cụ và hoỏ chất: lọ chứa formol 10%, dao, kộo, panh kẹp, cốc ủựng hoỏ chất, phiến kớnh, mỏy ủỳc block, khuụn ủỳc, tủ ấm 370C, mỏy cắt mảnh microtom, nước ấm 500C, xylen, parafin, thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin…
+ Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là ruột, mớ mắt, dạ dày tuyến, nóo…
- Cốủịnh bệnh phẩm
Ngõm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chỳ ý bệnh phẩm phải ngập trong focmol, thể tớch của formol phải gấp ớt nhất 10 lần thể tớch của bệnh phẩm ủem ngõm). Tuỳ thuộc vào kớch thước và số lượng bệnh phẩm
ủem ngõm mà sau từ 10-15 ngày, bệnh phẩm sẽ "chớn" và cú thểủem vựi ủỳc bệnh phẩm ủể cắt làm tiờu bản vi thể và hoỏ miễn dịch.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 35 - Vựi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt cỏc bước sau:
Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bỡnh formol 10%, cắt thành cỏc miếng cú chiều dài, rộng khoảng 4–5mm cho vào khuụn ủỳc bằng nhựa. ðem rửa dưới vũi nước chảy nhẹ trong 24 giờủể rửa sạch formol.
Sau ủú ủưa mẫu vào hệ thống mỏy chuyển ủỳc mẫu tự ủộng trong 18 giờ, lấy mẫu ra và tiến hành ủỳc block.
- ðỳc block:
+ Mục ủớch: ủể vựi miếng tổ chức trong mụi trường parafin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
+ Chuẩn bị: mỏy ủỳc block, mỏy làm lạnh block, parafin. + Phương phỏp tiến hành:
ðặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chớnh giữa khuụn block, sau ủú ủổ nhanh parafin lỏng vào block.
ðặt khuụn ủó ủỳc sang bàn lạnh của mỏy làm nguội block. ðể nguội từ
từ ủến khi ủụng cứng, ủặc chắc là ủược (nhiệt ủộ của mỏy làm nguội block thớch hợp 40C, khụng nờn cho nhiệt ủộ thấp hơn vỡ sẽ làm cho parafin giũn sẽ
khú cắt).
- Cắt dỏn mảnh:
+ Chuẩn bị: mỏy cắt, dao cắt, nước ấm 500C, phiến kớnh, panh kẹp... + Cắt mảnh: cắt bằng mỏy microtom với ủộ mảnh cắt khoảng 3-4àm, sao cho mảnh cắt khụng rỏch nỏt phần tổ chức.
+ Tói mảnh: sau khi cắt ủược, dựng panh kẹp mảnh cắt ủặt vào nước lạnh sau ủú dựng phiến kớnh trong, sỏng, khụng xước hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 500C rồi lấy kớnh vớt mảnh cắt sao cho vị trớ mảnh cắt ở 1/3 phiến kớnh. Sau ủú ủể khay ấm 400C - 450C khoảng 6-12h khi bệnh phẩm cố ủịnh chắc trờn phiến kớnh là cú thểủem nhuộm ủược.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 36
* Nhuộm tiờu bản: Cỏc bước:
+ Khử parafin: cho tiờu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 6h Xylen II: 6h Xylen III: 12h + Khử xylen: cho tiờu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ:
Cồn 1000: 2lần (mỗi lần 1 phỳt); Cồn 950: 1 lần; Cồn 700: 1 lần; Cồn 500: 1 lần. + Khử cồn: cho dưới vũi nước chảy 15 phỳt.
+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhõn)
Khi nhấc tiờu bản ra khỏi nước lau khụ xung quanh tiờu bản, nhỏ
haematoxylin ngập tiờu bản. ðể trong khoảng hơn 5 phỳt sau ủú ủổ thuốc nhuộm ủi, rửa qua nước. ðem lau sạch nước xung quanh tiờu bản và vẩy khụ
ủi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiờu bản xanh tớm là ủược.
Nếu nhạt màu thỡ nhỳng tiờu bản qua NaHCO3 1% (30 giõy). Nếu ủậm quỏ thỡ nhỳng tiờu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + HCl 1%) trong 30 giõy.
Sau khi ủiều chỉnh màu ta rửa sạch tiờu bản bằng nước cất. Sau ủú cho tiờu bản qua hệ thống cồn: Cồn 500: 1 lần; Cồn 700: 1 lần; Cồn 950: 1 lần; Cồn