ðể xỏc ủịnh ủược cỏc biến ủổi ủại thể của cỏc cơ quan, tổ chức của gà mắc bệnh Newcastle cần tiến hành mổ khỏm những gà cú biểu hiện triệu chứng lõm sàng của bệnh. Gà ủược lấy mỏu từ tĩnh mạch. Lột da, lụng và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tỏch cỏc cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sỏt và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu cỏc cơ quan như: phổi, ruột, nóo, mớ mắt, tuyến tụy, manh tràng, tim, gan, lỏch…ngõm trong formol 10% ủể làm tiờu bản vi thể.
3.5.3. Phương phỏp làm tiờu bản vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm cú cỏc biến ủổi ủại thể cần tiến hành làm tiờu bản ủể xỏc ủịnh bệnh tớch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương phỏp làm tiờu bản vi thể theo quy trỡnh tẩm ủỳc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE). Cỏc bước của quỏ trỡnh làm tiờu bản vi thể như sau:
- Chuẩn bị
+ Dụng cụ và hoỏ chất: lọ chứa formol 10%, dao, kộo, panh kẹp, cốc ủựng hoỏ chất, phiến kớnh, mỏy ủỳc block, khuụn ủỳc, tủ ấm 370C, mỏy cắt mảnh microtom, nước ấm 500C, xylen, parafin, thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin…
+ Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là ruột, mớ mắt, dạ dày tuyến, nóo…
- Cốủịnh bệnh phẩm
Ngõm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chỳ ý bệnh phẩm phải ngập trong focmol, thể tớch của formol phải gấp ớt nhất 10 lần thể tớch của bệnh phẩm ủem ngõm). Tuỳ thuộc vào kớch thước và số lượng bệnh phẩm
ủem ngõm mà sau từ 10-15 ngày, bệnh phẩm sẽ "chớn" và cú thểủem vựi ủỳc bệnh phẩm ủể cắt làm tiờu bản vi thể và hoỏ miễn dịch.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 35 - Vựi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt cỏc bước sau:
Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bỡnh formol 10%, cắt thành cỏc miếng cú chiều dài, rộng khoảng 4–5mm cho vào khuụn ủỳc bằng nhựa. ðem rửa dưới vũi nước chảy nhẹ trong 24 giờủể rửa sạch formol.
Sau ủú ủưa mẫu vào hệ thống mỏy chuyển ủỳc mẫu tự ủộng trong 18 giờ, lấy mẫu ra và tiến hành ủỳc block.
- ðỳc block:
+ Mục ủớch: ủể vựi miếng tổ chức trong mụi trường parafin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
+ Chuẩn bị: mỏy ủỳc block, mỏy làm lạnh block, parafin. + Phương phỏp tiến hành:
ðặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chớnh giữa khuụn block, sau ủú ủổ nhanh parafin lỏng vào block.
ðặt khuụn ủó ủỳc sang bàn lạnh của mỏy làm nguội block. ðể nguội từ
từ ủến khi ủụng cứng, ủặc chắc là ủược (nhiệt ủộ của mỏy làm nguội block thớch hợp 40C, khụng nờn cho nhiệt ủộ thấp hơn vỡ sẽ làm cho parafin giũn sẽ
khú cắt).
- Cắt dỏn mảnh:
+ Chuẩn bị: mỏy cắt, dao cắt, nước ấm 500C, phiến kớnh, panh kẹp... + Cắt mảnh: cắt bằng mỏy microtom với ủộ mảnh cắt khoảng 3-4àm, sao cho mảnh cắt khụng rỏch nỏt phần tổ chức.
+ Tói mảnh: sau khi cắt ủược, dựng panh kẹp mảnh cắt ủặt vào nước lạnh sau ủú dựng phiến kớnh trong, sỏng, khụng xước hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 500C rồi lấy kớnh vớt mảnh cắt sao cho vị trớ mảnh cắt ở 1/3 phiến kớnh. Sau ủú ủể khay ấm 400C - 450C khoảng 6-12h khi bệnh phẩm cố ủịnh chắc trờn phiến kớnh là cú thểủem nhuộm ủược.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 36
* Nhuộm tiờu bản: Cỏc bước:
+ Khử parafin: cho tiờu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 6h Xylen II: 6h Xylen III: 12h + Khử xylen: cho tiờu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ:
Cồn 1000: 2lần (mỗi lần 1 phỳt); Cồn 950: 1 lần; Cồn 700: 1 lần; Cồn 500: 1 lần. + Khử cồn: cho dưới vũi nước chảy 15 phỳt.
+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhõn)
Khi nhấc tiờu bản ra khỏi nước lau khụ xung quanh tiờu bản, nhỏ
haematoxylin ngập tiờu bản. ðể trong khoảng hơn 5 phỳt sau ủú ủổ thuốc nhuộm ủi, rửa qua nước. ðem lau sạch nước xung quanh tiờu bản và vẩy khụ
ủi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiờu bản xanh tớm là ủược.
Nếu nhạt màu thỡ nhỳng tiờu bản qua NaHCO3 1% (30 giõy). Nếu ủậm quỏ thỡ nhỳng tiờu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + HCl 1%) trong 30 giõy.
Sau khi ủiều chỉnh màu ta rửa sạch tiờu bản bằng nước cất. Sau ủú cho tiờu bản qua hệ thống cồn: Cồn 500: 1 lần; Cồn 700: 1 lần; Cồn 950: 1 lần; Cồn 1000: 2 lần
Rửa tiờu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương).
Bảng 3.1. Hệ thống chuyển ủỳc mẫu tựủộng
Bỡnh Húa chất Thời gian
(giờ) Bỡnh Húa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 7 Cồn 1000C 1:30 2 Cồn 600C 1:00 8 Cồn 1000C 1:30 3 Cồn 700C 1:30 9 Xylen 1:30 4 Cồn 800C 1:30 10 Xylen 1:30 5 Cồn 960C 1:30 11 Parafin 2:00 6 Cồn 1000C 1:30 12 Parafin 2:00
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 37
Nhỏ Eosin ngập tiờu bản khoảng 5-10 phỳt tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau ủú rửa nước chảy 15 phỳt cho hết Eosin thừa bỏm trờn phiến kớnh.
Cho tiờu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phỳt.
+ Tẩy cồn, làm trong tiờu bản: cho tiờu bản ủi qua hai lọ xylen mỗi lọ 3 phỳt.
- Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lờn lamen rồi gắn nhanh lờn tiờu bản khi vẫn cũn xylen trờn tiờu bản. Ấn nhẹủể dồn hết bọt khớ ra ngoài.
- ðỏnh giỏ kết quả:
ðem soi lờn kớnh hiển vi quang học vật kớnh 10. Nếu thấy nhõn bắt màu xanh tớm, bào tương bắt màu ủỏ tươi, tiờu bản trong sỏng, khụng cú nước, khụng cú bọt khớ là ủược.
3.5.4.Phương phỏp ủếm hồng cầu, bạch cầu bằng buồng ủếm Newbauer:
- Chuẩn bị: Buồng ủếm hồng - bạch cầu Newbauer, dung dịch pha
loóng hồng bạch cầu (chung cho cả ủếm hồng cầu và bạch cầu), ống pha loóng hồng bạch cầu, kớnh hiển vi quang học, la men, cồn bụng,
a) ðếm hồng cầu
- Hỳt mỏu vào ống pha loóng ủến vạch 0,5, dựng bụng lau sạch bờn ngoài. - Lập tức hỳt tiếp dung dịch pha loóng vừa ủủủến vạch 101.
- Lấy ống cao su ra rồi lấy ngún tay bịt kớn 2 ủầu ống lại ủảo nhẹ cho mỏu trộn ủều.
- ðậy lamen lờn buồng ủếm, nhỏ dung dịch pha (trước khi nhỏ phải bỏ ủi 1 - 2 giọt ủầu). ðợi 2 - 3 phỳt sau cho hồng cầu ổn ủịnh, ta bắt ủầu ủếm.
- Cỏch ủếm:
ðếm 5 ụ trung bỡnh, mỗi ụ trung bỡnh cú 16 ụ nhỏ ở 4 vị trớ gúc và chớnh giữa. Khi ủếm, ta ủếm lần lượt theo hỡnh chữ Z, chỉ ủếm những hồng cầu phớa trong, nằm trờn cạnh trờn và cạnh bờn phải ụ nhỏ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 38
- Cỏnh tớnh:
Gọi M là số hồng cầu ủếm ủược ở 5 ụ trung bỡnh thỡ số hồng cầu trong 1mm3 là M x 10.000
b) ðếm bạch cầu:
- Hỳt mỏu vào ống pha loóng ủến vạch 0,5. - Hỳt dung dịch pha loóng ủến vạch 11.
- Bỏống cao su ra dựng tay bịt kớn 2 ủầu, lắc nhẹ cho mỏu trộn ủều. - ðậy lamen lờn buồng ủếm, nhỏ một giọt dung dịch pha loóng, sau khi
ủó bỏ di 1 - 2 giọt ban ủầu ta ủợi 2 - 3 phỳt sau thỡ ủếm.
- Cỏch ủếm:
ðếm trong ụ vuụng lớn ở giữa hay 25 ụ trung bỡnh hay 400 ụ vuụng con.
- Cỏch tớnh:
Gọi số bạch cầu ủếm ủược trong 4 ụ là N thỡ số lượng bạch cầu cú trong 1mm3 là N x 2000.
3.5.5. Phương phỏp làm huyết sắc tố Shalli
- Nguyờn tắc:
Cho axit HCl vào mỏu sẽ kết hợp với huyết sắc tố tạo thành Hematin màu nõu, sau ủú so màu với ống chuẩn.
- Thuốc thử: HCl 0, 1N hoặc 1%.
- Thao tỏc:
Cho dung dịch HCl 0, 1N vào ống ủến vạch 10. Dựng mỏu hỳt ủến vạch 20. Dựng bụng lau sạch những vết mỏu ngoài ống. Cho ống hỳt xuống tận ủỏy ống ủo thổi nhẹ mỏu xuống ống hỳt và hỳt lờn thổi xuống nhiều lần ủể
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 39
ðể 10 phỳt sau, rồi pha loóng từ từ với nước cất ủến lỳc mỏu của ống
ủo và mỏu của ống chuẩn bằng nhau thỡ thụi. ðọc kết quả trờn cột số, ủú là số
gam huyết sắc tố trong 100ml mỏu.
Nếu pha loóng dung dịch quỏ sớm, kết quả ủịnh lượng sẽ sai. Nếu cho mỏu vào chỉ 1 phỳt sau pha loóng, kết quả chỉ bằng 75% so với thực tế vỡ chỉ
cú 75% huyết sắc tố chuyển thành Hematin, nếu 5 phỳt sau pha loóng thỡ cú 88% và 2 gời sau là 100%. Sau 10 phỳt pha loóng, chỉ cú 90% lượng huyết sắc tố chuyển thành màu nõu. Những ống mẫu của bộ huyết sắc kế Shalli ủó
ủược pha trong ủiều kiện ủú.
- Sau mỗi lần ủo phải rửa sạch bằng nước cất.
- ðơn vị tớnh: %.
3.5.6 Phương phỏp Hematocrit
- Dụng cụ:
Mỏy ly tõm TH - 12, ống ly tõm, thước ủọc kết quả, sỏp ong bịt ống ly tõm.
- Cỏch làm:
Lấy mỏu chống ủụng vào ống Hematocrit cho ủầy ống sao cho khụng cú lẫn bọt khớ ở trong, bịt kớn một ủầu ống bằng sỏp ong khoảng 1 - 2mm ủem
ủặt vào mỏy ly tõm sao cho ủối xứng nhau (ủặt cỏc ủầu bịt sỏp ong hướng ra ngoài), ly tõm với vận tốc 3000 vũng /phỳt trong vũng 10 - 15 phỳt. Sau ủú lấy ra ủem so trờn thước ủểủọc kết quả.
- ðơn vị tớnh: %.
- Thể tớch bỡnh quõn hồng cầu: ủược tớnh theo cụng thức sau:
Tỷ khối hồng cầu (%) Vtb =
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 40
- Lượng huyết sắc tố (Hemoglobin) bỡnh quõn hồng cầu: (LHbBQ)
Biểu thị lượng huyết sắc tố trong mỗi hồng cầu, ủược tớnh theo cụng thức: Hb (%) x 10
LHbBQ =
Số lượng hồng cầu (triệu/mm3) Pg Nồng ủộ huyết sắc tố bỡnh quõn hồng cầu: (NðHbBQ)
Biểu thị tỷ lệ % huyết sắc tố chứa trong 100ml hồng cầu hoặc tỷ lệ % huyết sắc tố so với thể tớch mỗi hồng cầu
Hb (%) x 100 NðHbBQ =
Tỷ khối hồng cầu (%) (%)
- Cụng thức bạch cầu theo phương phỏp Macgregor trờn tiờu bản mỏu nhuộm giemsa.
3.5.7. Phương phỏp chẩn ủoỏn Huyết thanh học: HA. HI
- Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà hay phản ứng HI (Haemagglutinaion Inhibition Test).
+ Chuẩn bị: huyết thanh Newcastle. Nước trứng chứa virus ở hiệu giỏ HA là 4 HA. Hồng cầu gà 1 %.
+ Chuẩn bị khay nhựa cú 96 giếng ủỏy trũn với cỏc dụng cụ chuyờn dựng nhưống hỳt cú ủịnh khối lượng và que trộn.
+ Dựng 8 giếng thớ nghiệm và 1 giếng ủối chứng dương và 1 giếng ủối chứng õm.
+ Cho huyết thanh Newcastle vào mỗi giếng một lượng là 0,25ml, nhưng ở
cỏc hiệu giỏ pha loóng khỏc nhau lần lượt từ giếng 1 ủến giếng 8 là 1/10, 1/20, 1/40, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280.
+ Cho vào tất cả 8 giếng thớ nghiệm mỗi giếng 0,25ml nước trứng cú chứa virus ở hiệu giỏ là 4 ủơn vị ngưng kết hồng cầu.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 41
Lắc ủều ủể cho virus và huyết thanh trộn lẫn vào nhau, ủể yờn 5 – 10 phỳt. + Cho vào tất 8 giếng 0,5ml hồng cầu gà 1%
Ở giếng ủối chứng dương cho 0,25ml nước trứng; 0,5ml hồng cầu và 0,25ml nước sinh lý.
Ở giếng ủối chứng õm cho 0,5ml hồng cầu gà 1% và 0,5ml nước sinh lý. Tất cả cỏc giếng thớ nghiệm ủều cú thể tớch là 1ml.
Lắc ủều tất cả cỏc giếng và ủể yờn trong vũng 15 – 20 phỳt rồi ủọc kết quả.
+ ðọc kết quả: Phản ứng dương tớnh là hồng cầu ngưng kết thành cừng hạt lấm tấm màu ủỏ (quầng ủỏ rạn nứt dưới ủỏy ống nghiệm).
3.5.8. Phương phỏp nhuộm hoỏ mụ miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC)
Phương phỏp nhuộm hoỏ mụ miễn dịch (IHC) cú quy trỡnh tẩm ủỳc bằng parafin giống phương phỏp làm tiờu bản vi thể.
* Cỏc bước nhuộm:
Bước 1: Làm sạch tiờu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương phỏp làm tiờu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vũi nước rửa lại tiờu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hoỏ enzym
Ngõm ngập tiờu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 1210C/5 phỳt.
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dựng H2O2 trong dung mụi Methanol (1H2O2 30%:9Methanol). Ngõm tiờu bản trong 10 phỳt.
Bước 4: Gắn khỏng thể (KT)
Nhỏ 105 àl KT khỏng ND chuẩn lờn tiờu bản, cho tiờu bản vào khay
ủựng giấy thấm cú PBS.
ðể tủấm 370C/1h hoặc 40C/qua ủờm.
Rửa tiờu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phỳt/lần).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 42
Nhỏ 3 giọt = 105 àl khỏng khỏng thể lờn tiờu bản, cho tiờu bản vào khay ủựng giấy thấm cú PBS.
ðể tủấm 370C/30 phỳt - 1h. Rửa PBS 3 lần (5phỳt/lần).
Bước 6: Cho cơ chất
Nhỏ 3 – 4 giọt dung dịch DAB lờn tiờu bản trong khoảng 1 phỳt. Quan sỏt sự chuyển biến màu sắc và ủọc kết quả.
Rửa tiờu bản bằng nước trong 2 – 3 phỳt
Bước 7: Nhuộm nhõn tế bào bằng Hematoxylin (trong 20 giõy), làm sạch tiờu bản bằng cồn và xylen. Cồn 700: 1 lần; Cồn 800: 1 lần; Cồn 900: 2 lần; Cồn 950: 2 lần; Cồn 1000: 2 lần; Xylen: 3 lần
Gắn Baume canada: Nhỏ một giọt Baume canada lờn lamen rồi gắn nhanh lờn tiờu bản khi vẫn cũn xylen trờn tiờu bản. Kiểm tra tiờu bản trờn kớnh hiển vi quang học.
3.5.9. Phương phỏp xử lý số liệu
Sau khi thu thập số liệu, tổng kết sơ bộ ủược xử lý bằng phương phỏp thống kờ sinh học với cỏc tham số và sử dụng chương trỡnh Excel trờn mỏy vi tớnh.: - Số trung bỡnh: X = n xi ∑ - ðộ lệch chuẩn: Sx = 1 ) ( − − ∑ n x xi - Sai số của số trung bỡnh 30 n 1 mx ≥ − ± = n S ; n S ± = mx n = 30
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 43
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TRIỆU CHỨNG, BỆNH TÍCH ðẠI THỂ CỦA BỆNH NEWCASTLE Ở GÀ ISA BROWN (20 – 22 TUẦN TUỔI) NEWCASTLE Ở GÀ ISA BROWN (20 – 22 TUẦN TUỔI)
4.1.1 Kết quả khảo sỏt triệu chứng lõm sàng gà mắc bệnh Newcastle.
Quan sỏt trờn 348 gà mắc bệnh Newcastle ở cỏc ủàn gà từ 20 ủến 22 tuần tuổi chỳng tụi thấy:
Dấu hiệu ủầu tiờn là cỏc triệu chứng: ủ rũ, mệt mỏi vỡ con vật thường sốt cao, gà thường ủứng tập trung một chỗ ủể giữ nhiệt ủộ cho nhau. Gà xự lụng, cỏnh só, lụng xơ xỏc giống khoỏc ỏo tơi.
Trờn nền chuồng quan sỏt thấy cú một số ủống phõn trắng, phõn xanh, loóng cú nhiều nước, cú bọt.
Khi bắt từng gà lờn, sờ vào diều cảm thấy giống như sờ vào tỳi bột