- PBS * Tiến hành:
3.4.6 Phản ứng ELISA gián tiếp kiểm tra hiệu giá kháng thể Nguyên tắc:
Nguyên tắc:
Cơ chế kết hợp kháng nguyên kháng thể (KN Ờ KT): Khi ựem trộn KN với KT ựặc hiệu tương ứng thì chúng có thể tác dụng với nhau. Sự kết hợp ựó nhiều khi có thể nhìn thấy bằng mắt thường (phản ứng ngưng kết huyết thanhẦ) ựược dưới hình thức lên bông, kết tủa hay ngưng. Hoặc có thể dựa trên một số phản ứng riêng biệt trong miễn dịch.
Sự kết hợp này mang tắnh ựặc hiệu: Một kháng nguyên chỉ kết hợp ựược với một kháng thể ựặc hiệu và ngược lại.
Ngoài ra nó còn mang tắnh khả hồi: Phức hợp KN Ờ KT có thể bị tách rời ra bởi nhiệt ựộ hay toan hoá môi trường. Vì thế người ta có thể tách KN và KT rời nhau ra ngay sau hình thành phức hợp.
Phản ứng ELISA:
ELISA (Enzyme link immunosorbert Assay ): có nhiều loại phản ứng ELISA : ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA cạnh tranh, và Sandwich ELISA. Các phản ứng này ựược tiến hành theo các trình tự khác nhau, ựược ứng dụng trong việc chuẩn ựoán các bệnh khác nhau nhưng nguyên lý chung của chúng là phản ứng kết hợp KN Ờ KT với sự có mặt của một enzyme (thường sử dụng peroxidase ) có ý nghĩa như một chất chỉ thị.
Phản ứng ELISA gián tiếp (Indirect ELISA ): Phản ứng sử dụng KN chuẩn ựã biết ựể xác ựịnh kháng thể. Thường dùng ựể chuẩn ựoán các bệnh truyền nhiễm. Ngoài ra nó còn ựược sử dụng ựể xác ựịnh sự biến thiên hàm lượng kháng thể.
- Nguyên liệu:
+ đĩa ELISA : ựĩa bằng chất liệu nhựa polypropylene có 96 giếng, có khả năng hấp thụ kháng nguyên tốt- Costar.
+ Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ, conjugate(chất gắn kết) có gắn enzmyme peroxydase, Subtrate (chất tạo màu phản ứng, thường là TMBZ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 45
(3,3Ỗ,5,5Ỗ Tetramethybenzodine)), PBS, PBS-Tween, Sữa tách bơ (casein). + Máy ựọc phản ứng
+ Các dụng cụ thắ nghiệm - Trình tự phản ứng:
+ Kháng nguyên (pha loãng ở nồng ựộ thắch hợp) ựược gắn trực tiếp vào ựĩa ELISA (dùng pipét nhỏ 200ộl mỗi giếng. Thông thường kháng nguyên ựược ủ qua ựêm ở nhiệt ựộ 4oC hoặc 37oC trong 2h. Sau khi kháng nguyên ựược ủ trong ựĩa, ựổ bỏ dung dịch có trong ựĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS có chứa Tween 20 (phosphate Buffer Saline) rửa ựĩa 3 lần, và ựập khô (sau mỗi lần rửa phải ựập khô)
+ Tiến hành Block ựĩa: Các khoảng trống trong ựĩa ựược phủ bằng dung dịch PBS - sữa tách bỏ 5%, dùng pipet nhỏ 200ộl mỗi giếng, ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ sau ựó hắt bỏ dung dịch sữa trong các giếng. Rửa sạch ựĩa 3 lần với PBS Ờ Tween 0,05% và ựập khô ựĩa.
+ Kháng thể (là huyết thanh thỏ) pha loãng ở nồng ựộ thắch hợp bằng dung dịch PBS Ờ sữa tách bơ 5%, nhỏ 100ộl mỗi giếng . Kháng thể ủ trong ựĩa ở nhiệt ựộ 37o C, lắc sau 30 phút. Sau khi ủ, hắt bỏ dung dịch trong các giếng, rửa ựĩa 5 lần với PBS Ờ Tween và ựập khô. Chú y lần rửa thứ nhất tránh ựể tràn giếng.
+ Conjugate thường pha loãng bằng PBS với ựộ pha loãng là 10000 lần, nhỏ 100ộl mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau ựó lại hắt bỏ dung dịch trong giếng và rửa ựĩa 6 lần với PBS Ờ Tween 0,05% và ựập khô.
+ Substrade chỉ pha sau khi rửa ựĩa. Substrade ựược nhỏ 100ộl mỗi giếng, ựể nhiệt ựộ phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 46
+ Sau ựó dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 0,1 Ờ 2 M, lúc này phản ứng có màu vàng.
+ đĩa phản ứng ựược ựọc trên máy ựọc ựĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.