3. NỘI DUNG, NGHUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊU CỨU 29-
3.2.3. Giám ựịnh virut gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản bằng phưong
phưong pháp RT-PCR (Quy trình chẩn ựoán Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản, Trung tâm chẩn ựoán thú y TW, 2008).
- Phạm vi áp dụng: Quy trình ựược áp dụng ựể xét nghiệm phát hiện virut PRRS tại các phòng xét nghiệm chẩn ựoán bệnh ựộng vật thuộc Cục thú y.
Bệnh phẩm: huyễn dịch bệnh phẩm, huyết thanh hoặc dịch nổi tế bào sau khi phân lập virut.
Máy móc và nguyên liệu: - Hệ thống chiết tách ARN - Máy Realtime PCR - Bộ Micropipet các cỡ
- Kit chiết tách ARN (Qiagen hoặc Ambion Magmax)
- Kit RT-PCR: Qiagen one step RT-PCR kit (Cat No.210210) hoặc Invitrogen supercript III qRT-PCR kit (Cat No.12574-026).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... - 32 -
* Cách tiến hành
- Chiết tách ARN: áp dụng theo quy trình của nhà sản xuất + Chuẩn bị master mix
Qiagen one-step Reagent RT-PCR kit Lượng (ộộộộl) Invitrogen SS3 Reagent qRT-PCR kit Lượng (ộộộộl) DW 10.5 DW 4.5
5x Reaction Mix 5.0 5x Reaction Mix 12.5
MgCl2 (25mM) 1.2 MgCl2 (25mM) 1.0
dNTP 0.8
PPP 1.5 PPP 1.5
Enzyme Mix 1.0 Enzyme Mix 0.5
- Cho 20 ộl master mix vào ống PCR
- Cho 5 ộl mẫu ARN vào ống PCR
- đặt ống PCR vào máy Realtime PCR - Chạy chương trình
- Chọn ựọc màu ở bước kéo dài + Chạy phản ứng.
Qiagen one-step Reagent Invitrogen SS3 Reagent
RT PCR RT PCR 500CỜ30m 500CỜ30m 950CỜ15m 40 x (95 0CỜ10s + 600CỜ50s) 950CỜ2m 40 x (95 0CỜ10s + 600CỜ50s)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... - 33 -
*) đọc kết quả:
Xét nghiệm ựược công nhận khi:
- đối chứng dương tắnh cho giá trị Ct ựã biết (ổ2) - đối chứng âm tắnh không có Ct
- Mẫu ựược coi là dương tắnh khi có Ct ≤ 35 - Mẫu ựược coi là âm tắnh nếu không có Ct - Mẫu ựược coi là nghi ngờ nếu Ct ≥ 35
Danh mục và trình tự primer và probe
Modification Tên Primer/probe Sequence (5Ỗ-3Ỗ)
5Ỗ 3Ỗ
Probe TGT GGT GAA TGG CAC TGA TTG ACA FAM BHQ1
Forward ATG ATG RGC TGG CAT TCT None None
PRRS-1 (NA)
Reverse ACA CGG TGG CCC TAA TTG None None
Probe CCT CTG CTT GCA ATC GAT CCA GAC FAM BHQ1
Forward GCA CCA CCT CAC CCA GAC None None
PRRS-2 (EU)
Reverse CAG TTC CTG CGC CTT GAT None None
Probe CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA HEX BHQ1
Forward CCCAAGCTGATGACACCTTTG None None
PRRS- China (JVM)
Reverse AATCCAGAGGCTCATCCTGGT None None
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... - 34 -
Sau khi thu thập số liệu, tổng hợp sơ bộ ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học thông qua phần mềm Excel trên máy vi tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... - 35 -