3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của ựề tài
1.8.3 Các chất ựiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô hoa Lan
Trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì việc ứng dụng các chất ựiều hòa sinh trưởng là hết sức quang trọng. Hai nhóm chất ựược sử dụng nhiều nhất là Auxin (là nhóm chất quyết ựịnh hình thành rễ) và Cytokinin (là nhóm quyết ựịnh hình thành chồi). để nhân nhanh in vitro, trong giai ựoạn ựầu cần phải ựiều khiển mô nuôi cấy phát sinh thật nhiều chồi ựể tăng hệ số nhân. Vì vậy người ta tăng nồng ựộ Cytokinin trong nuôi cấy[1].
Trong nuôi cấy mô thực vật Auxin ựược sử dụng ựể kắch thắch sự phân chia tế bào, biệt hóa rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi hoặc tạo rễ phụ [ 1]. Trong một số trường hợp, mẫu nuôi cấy có thể sản sinh ra Auxin ngoại sinh [11]. Các Hoocmon thuộc nhóm Auxin hay sử dụng là : α- NAA, IAA, IBA, 2,4D.
Theo các tác giả Chamchuree- Sottkul (1991), Ghojwani (1982) Cytokinin có tác dụng kắch thắch sự phân chia tế bào, phát sinh chồi nách, kìm hãm tắnh trội của chồi ựỉnh, tham gia ựiều hòa sinh trưởng ở tất cả các pha phát triển từ khi hạt nảy mầm ựến khi già. Sự có mặt của Cytokinin ựôi khi kìm hãm sự phát triển của rễ. Trong nhóm Cytokinin thì có 2 loại sau ựây là phổ biến nhất: Kinitine (6 Furfuryl aminopurin), BAP (6 Benzyl Amino Purin) là những Cytokinin hay ựược sử dụng với nồng ựộ trung bình 0,5 - 10 mg/l và ựược pha loãng trong HCl và NaOH. Người ta còn phát hiện ra Kinitine có nhiều trong Nước Dừa [24][30]
Theo Dương Tấn Nhựt và CS (2008) việc phối hợp giữa Auxin và Cytokinin có tác dụng hỗ trợ cho nhau ựể tái sinh cây hoàn chỉnh. Nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao sẽ kắch thắch mô phát sinh rễ, ngược lại ở tỷ lệ thấp sẽ phát sinh chồi, còn ở mức trung gian, mô sẽ sinh nhiều mô sẹọ Có khoảng 20 loại Hoocmon khác nhau thuộc nhóm Gibberenin nhưng chỉ có Gibberelic axid A3 (GA3) ựược sử dụng với mục ựắch kéo dài ựốt, kắch thắch sự sinh trưởng của chồi (Peirik. 1987). Gibberellin giúp cho các chồi ựỉnh phát sinh nhanh hơn hoặc biến các phôi vô tắnh thành câỵ nó cũng có thể phá ngủ các
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 31 phôi hoặc tách rời hạt. tác dụng ức chế, tạo rễ phụ và chồi phụ (Streẹ1973) Trong nuôi cấy người ta cũng sử dụng Abscisic axit (ABA) nó là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên thường ảnh hưởng âm tắnh lên mẫu cấy in vitrọ
Tuy nhiên người ta còn cho thêm các chất phụ gia vào môi trường nuôi cấy mô như nước Dừa, nước chiết dịch Men, nước Cà chua ép, dịch Khoai tây, dịch Chuối xanhẦ ựể kắch thắch sự phát triển của một số cơ quan thực vật trong quá trình nuôi cấy[22].
Công bố ựầu tiên về nước Dừa sử dụng trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và công sự, 1941,1942. và (George,1993,1996) ựược xác ựịnh là giầu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kắch thắch sinh trưởng, và ựược sử dụng ựể kắch thắch phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây trồng, dịch chiết của Cà chua, Cà rốt, Khoai tây, Chuối xanhẦ cũng ựược sử dụng trong nuôi cấy mô ựể làm tăng phát triển của mô sẹo hay các cơ quan nuôi cấy[23].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 32
CHƯƠNG 2: đỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 đối tượng nghiên cứu
- đối tượng nghiên cứu: Lan Hồ ựiệp Phát quang (Phalaenopsis sp.
Blume) và Lan Phượng vĩ (Renanthera coccinea Lour) ở thể protocorm.
Ảnh 2.1. Lan Hồ ựiệp Phát quang Ảnh 2.2. Lan Phượng vĩ
- Vật liệu nghiên cứu:
1) Thành phần môi trường nền Vacin and Went (1949) có bổ sung 20 gam đường saccarose + 7 gam Agar + 0,2 gam Than hoạt tắnh.
2) Một số chất ựiều tiết sinh trưởng như Benzyn Amino Purin (BAP), Kinitinee (Ki), α -Naphthalene Acetic Acid (α-NAA), Indol Butyric Acid (IBA).
3) Hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên như: Khoai Tây, Chuối Xanh, Cà rốt, Cà Chua, Nước Dừạ
4) Giá thể trồng cây là rong biển
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 33
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ựiều tiết sinh trưởng và các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên ựến hệ số nhân chồi của Lan Hồ ựiệp Phát quang và Lan Phượng vĩ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ựiều tiết sinh trưởng và các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên ựến sự tái sinh cây hoàn chỉnh của Lan Hồ ựiệp Phát quang và Lan Phượng vĩ
- Nghiên cứu kỹ thuật ra cây ngoài vườn ươm ựối với Lan Hồ ựiệp Phát quang và Lan Phượng vĩ
Các nội dung nghiên cứu ựược tóm tắt qua sơ ựồ sau:
Ị TẠO VẬT LIỆU KHỞI đẦU IỊ GIAI đOẠN NHÂN NHANH
Tập chung nghiên cứu các vấn ựề sau
1. Tác dụng của BAP 2. Tác dụng của Kinetin
3. Tác dụng của BAP và α- NAA 4. Tác dụng của Ki và α-NAA 5. Tác dụng của BAP và IBA 6. Tác dụng của Ki và IBA 7. Tác dụng của Khoai tây 8. Tác dụng của Chuối xanh 9. Tác dụng của Cà rốt 10. Tác dụng của Cà chua 11. Tác dụng của Nước dừa
12. Tác dụng của tổ hợp dịch Khoai Tây, Chuối Xanh, Cà Rốt, Cà Chua, Nước Dừạ IIỊ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH
1. Tác dụng của α-NAA 2. Tác dụng của IBA 3. Tác dụng của tổ hợp các hợp chất hữu cơ và α-NAA 4. Tác dụng của tổ hợp các hợp chất hữu cơ và IBA
IV. GIAI đOẠN VƯỜN ƯƠM 1. Ảnh hưởng của giá thể rong biển và phân bón Growmore (20:20:20) lên quá trình sinh trưởng.
Tạo cây hoàn chỉnh
Vườn ươm
12 thắ nghiệm
4 thắ nghiệm
1 thắ nghiệm đỉnh sinh trưởng của 2 giống
Nguồn vật liệu khởi ựầu (Protocorm)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 34
2.3.1 Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm bố trắ theo kiểu CRD, 3 lần nhắc lạị Lan Hồ ựiệp Phát quang trong giai ựoạn nhân nhanh mỗi lần nhắc là 5 cá thể và giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh mỗi lần nhắc là 10 cá thể. Lan Phượng vĩ trong giai ựoạn nhân nhanh và giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh là 10 cá thể trong một lần nhắc. Giai ựoạn vườn ươm theo dõi 30 cá thể trên 1 lần nhắc ựối với cả hai giống. Số lượng mẫu theo dõi trên tất cả các lần nhắc .
- Kỹ thuật trong giai ựoạn nhân nhanh
Sử dụng kỹ thuật tách chồi (protocorm) thành từng chồi (protocorm) rồi cấy vào môi trường nhân nhanh trong 12 thắ nghiệm sau, các chồi ựược cấy chuyển 8 tuần 1 lần trên nền môi trường VW + 20 g đường Saccarose + 7 g Agar + 0,2 g Than hoạt tắnh và các chất ựiều tiết sinh trưởng với nồng ựộ khác nhau tùy từng thắ nghiệm, nhằm tìm ra môi trường thắch hợp cho từng giống.
Thắ nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và BAP ựến hệ số nhân và chất lượng chồị Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 7 công thức với dải nồng ựộ BAP từ ( 0,00 mg ựến 0,7mg)
Thắ nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và Kinitine ựến hệ số nhân và chất lượng chồị Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 7 công thức với dải nồng ựộ Kinitine từ (0,00 mg ựến 0,7 mg).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 35 Thắ nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và tổ hợp của BAP và α-NAA ựến hệ số nhân, chất lượng chồi
Lan Hồ ựiệp Phát quang Lan Phượng vĩ Công thức BAP(mg) α-NAA (mg) BAP(mg) α-NAA (mg) 0 (đối chứng) 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,6 0,01 0,5 0,01 2 0,6 0,02 0,5 0,02 3 0,6 0,03 0,5 0,03 4 0,6 0,04 0,5 0,04 5 0,6 0,05 0,5 0,05 6 0,6 0,06 0,5 0,06 7 0,6 0,07 0,5 0,07
Thắ nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường VW và tổ hợp của Ki và α - NAA ựến hệ số nhân, chất lượng chồi
Lan Hồ ựiệp Phát quang Lan Phượng vĩ Công thức Ki (mg) α-NAA (mg) Ki (mg) α-NAA (mg) 0 (đối chứng) 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,5 0,01 0,4 0,01 2 0,5 0,02 0,4 0,02 3 0,5 0,03 0,4 0,03 4 0,5 0,04 0,4 0,04 5 0,5 0,05 0,4 0,05 6 0,5 0,06 0,4 0,06 7 0,5 0,07 0,4 0,07
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 36 Thắ nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường VW và tổ hợp của BAP và IBA ựến hệ số nhân , chất lượng chồi
Lan Hồ ựiệp Phát quang
Lan Phượng vĩ Công thức
BAP (mg) IBA (mg) BAP (mg) IBA ( mg)
0 (đối chứng) 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,6 0,01 0,6 0,01 2 0,6 0,02 0,6 0,02 3 0,6 0,03 0,6 0,03 4 0,6 0,04 0,6 0,04 5 0,6 0,05 0,6 0,05 6 0,6 0,06 0,6 0,06 7 0,6 0,07 0,6 0,07
Thắ nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường VW và tổ hợp của Ki và IBA ựến hệ số nhân, chất lượng chồi
Lan Hồ ựiệp Phát quang Lan Phượng vĩ Công thức Ki (mg) IBA ( mg) Ki (mg) IBĂ mg) 0 (đối chứng) 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,5 0,01 0,4 0,01 2 0,5 0,02 0,4 0,02 3 0,5 0,03 0,4 0,03 4 0,5 0,04 0,4 0,04 5 0,5 0,05 0,4 0,05 6 0,5 0,06 0,4 0,06 7 0,5 0,07 0,4 0,07
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 37 Thắ nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và dịch Khoai Tây ựến hệ số nhân, chất lượng chồị Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 7 công thức với Khoai tây từ 10 gam ựến 70 gam
Thắ nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và dịch Chuối Xanh ựến hệ số nhân, chất lượng chồị Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 7 công thức với Chuối Xanh từ 10 gam ựến 70 gam
Thắ nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và dịch Cà Rốt ựến hệ số nhân, chất lượng chồị Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 7 công thức với Cà Rốt từ 10 gam ựến 70 gam
Thắ nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và dich Cà Chua ựến hệ số nhân, chất lượng chồị Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 7 công thức với Cà Chua từ 10 ml ựến 70 ml
Thắ nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và Nước Dừa ựến hệ số nhân chồi, chất lượng chồị Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 7 công thức với Nước dừa từ 10 ml ựến 70 ml
Thắ nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và sự tổ hợp dịch hữu cơ ựến hệ số nhân , chất lượng chồi
Công thức Lan Hồ ựiệp Phát quang Lan Phượng vĩ
0 (đối chứng) VW VW
1 đ/C+ 50g KT + 20g CX đ/C +30g KT+ 20 g CX
2 đ/C+ 50g KT + 30g CR đ/C +30g KT + 20g CR
3 đ/C+ 50g KT + 40ml CC đ/C + 30 g KT + 20ml CC
4 đ/C+ 50g KT + 40ml ND đ/C + 30 KT + 30ml ND
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 38
- Kỹ thuật trong giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh
Trong giai ựoạn này sử dụng các chồi ở giai ựoạn nhân nhanh chọn những chồi ựạt tiêu chuẩn: đối với Lan Hồ ựiệp Phát quang có 2- 4 lá, chiều dài TB/ lá 2,00 cm, trọng lượng 0,4 - 0,6g , với Lan Phượng vĩ chiều cao cây 2,50 - 3,00 cm, số lá TB/chồi 4- 6 lá, trọng lượng 0,5 - 0,7 g , sau ựó ựược tách chuyển sang môi trường kắch thắch ra rễ qua 4 thắ nghiệm sau: Thắ nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và α - NAA ựến khả năng ra rễ. Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 5 công thức với nồng ựộ α- NAA từ 0,01 mg ựến 0,09 mg
Thắ nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và IBA ựến khả năng ra rễ. Thắ nghiệm ựược bố trắ trên 5 công thức với nồng ựộ IBA từ 0,01 mg ựến 0,09 mg.
Thắ nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và tổ hợp các hợp chất hữu và α- NAA ựến khả năng ra rễ.
Lan Hồ ựiệp Phát quang Lan Phượng vĩ Công thức HCHC α -NAA (mg) HCHC α- NAA (mg) 0(đ/C) VW 0,00 VW 0,00 1 đ/C+ 50g KT + 20g CX 0,07 đ/C +30g KT+ 20 g CX 0,05 2 đ/C+ 50g KT + 30g CR 0,07 đ/C +30g KT + 20gCR 0,05 3 đ/C+ 50g KT + 40mlCC 0,07 đ/C + 30g KT + 20mlCC 0,05 4 đ/C+ 50g KT + 40mlND 0,07 đ/C + 30 KT + 30ml ND 0,05
Ghi chú: đ/C là VW + 20g đường Saccarose + 7 g Agar + 0,2 g Than hoạt tắnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 39 Thắ nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường VW và tổ hợp các hợp chất hữu cơ và IBA ựến khả năng ra rễ
Lan Hồ ựiệp Phát quang Lan Phượng vĩ Công thức HCHC IBA (mg) HCHC IBA (mg) 0 (đC) VW 0,00 VW 0,00 1 đ/C+ 50g KT + 20g CX 0,07 đ/C +30g KT+ 20 g CX 0,07 2 đ/C+ 50g KT + 30g CR 0,07 đ/C +30g KT + 20g CR 0,07 3 đ/C+ 50g KT + 40mlCC 0,07 đ/C + 30 g KT + 20ml CC 0,07 4 đ/C+ 50g KT + 40mlND 0,07 đ/C + 30 KT + 30ml ND 0,07
Ghi chú: đ/C là VW + 20g đường Saccarose + 7 g Agar + 0,2 g Than hoạt tắnh
- Giai ựoạn vườm ươm
Cây con nghiên cứu trong ống nghiệm khi ựã ựược tái tạo thành cây hoàn chỉnh, có bộ lá, rễ khỏe ựược ựưa ra vườn ươm. Lan Hồ ựiệp Phát quang có 4 lá, chiều dài lá 2,5 - 3,0cm, có từ 3- 5 rễ, tương ứng với trọng lượng > 1,3gam. Lan Phượng vĩ có > 6 lá, chiều cao cây 5 - 6 cm, có từ 3- 4 rễ tương ứng với trọng lượng > 1,3 gam .
Thắ nghiệm này bố trắ trên nền giá thể rong biển[25], sử dụng phân bón Growmore (20:20:20) một tuần 1 lần với nồng ựộ 2 gam/lắt. Trồng từ tháng 5 ựến tháng 8 năm 2010 theo dõi tỷ lệ sống và sinh trưởng của chúng.
Thắ nghiệm ựược bố trắ hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc, mỗi lần nhắc 30 câỵ định kỳ theo dõi 4 tuần một lần.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 40
2.3.2 điều kiện thắ nghiệm
- Các thắ nghiệm nhân nhanh trong nuôi cấy mô ựược tiến hành trong ựiều kiện nhân tạo có thể ựiều chỉnh ựược chế ựộ ánh sáng, nhiệt ựộ.
+ Ánh sáng các mẫu nuôi cấy ựược ựặt dưới ánh sáng ựèn neon với cường ựộ chiếu sáng từ 2400 -3000lux
+ Quang chu kỳ từ 12-14 giờ/ngàỵ
+ Nhiệt ựộ duy trì ở trong phòng từ 20 -250C.
- Thắ nghiệm ở vườm ươm: ựược nghiên cứu trong ựiều kiện nhà lưới có mái che
2.3.3 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Giai ựoạn nhân nhanh
Hiệu quả của môi trường nhân nhanh ựược ựánh giá bằng các chỉ tiêu : - Hệ số nhân chồi( lần) = Tổng số chồi tạo thành / tổng số chồi ban ựầu - Chất lượng chồi ựược ựánh giá bằng cảm quan:
+++ : Chồi tốt ( Chồi to khỏe, xanh, lá ựều, chiều cao tùy thuộc vào từng ựối tượng)
++ : Trung bình(Chồi nhỏ, khỏe, xanh, lá không ựều chiều cao chồi thấp) + : Kém ( Chồi nhỏ, lá ắt, lá nhỏ mỏng, không ựều)
Giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh
Quá trình ra rễ ựược ựánh giá bằng chỉ tiêu :
- Tỷ lệ ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ/ số chồi ban ựầu - Số rễ TB / cây = Tổng số rễ các chồi tạo ra / tổng số chồi ban ựầu - độ dài rễTB/chồi (cm) = Tổng ựộ dài TB rễ của chồi / tổng số chồi ban ựầu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 41
Giai ựoạn vườn ươm
- Tỷ lệ sống (%) = Tổng số cây sống/ tổng số cây ban ựầu - Số lá TB /cây = Tổng số lá các cây / tổng số cây
- Chiều cao TB/cây (cm)= Tổng chiều cao của các cây(cm) / tổng số cây - Số rễ TB/ cây (cm) = Tổng số rễ các cây tạo ra / tổng số cây ban ựầu - độ dài rễTB/cây (cm) = Tổng ựộ dài TB rễ của cây / tổng số cây ban ựầu
2.3.4 Phương pháp sử lý số liệu
- Các trị số trung bình (X )ựược tắnh theo công thức
n xi
X = Σ
- độ lệch chuẩn. Hệ số biến ựộng. ựộ chắnh xác của thắ nghiệm S = 1 ) (