3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của ựề tài
1.8 Công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô hoa Lan
1.8.1 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô
Haberland (1902) ựã xây dựng các nguyên lý công nghệ sinh học của nuôi cấy mô và các cơ quan thực vật, P.R.White (1934) trồng rễ cây Cà chua in vitro nhằm cung cấp dịch men, ựến năm 1939 ba nhà khoa học là Nobecourt, Gautheret người Pháp và White người Mỹ ựã báo cáo ựộc lập về nuôi cấy nhiều loài thực vật trong môi trường tổng hợp. Những khám phá về Cytokinin và các Hoocmon ựiều khiển sự phát sinh chồi và rễ ở mô thuốc lá của Skoog và công sự (1948) ựã thiết lập cơ sở mở ựầu cho nhân các cơ quan thực vật. Nhiều phát hiện quan trọng sau ựó ứng dụng nuôi cấy in vitro như nuôi cấy bao phấn tạo cây ựơn bội, tách và lai tế bào trần Protoplast[28].
Các nghiên cứu của Morel (1960) trên Cymbidium cho thấy chỉ khi nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng 1mm với 2 tiền phát khởi lá mới thu ựược cây con sạch virus. đây là sự bắt ựầu của công nghệ nuôi cấy mô ở Pháp, sau ựó từ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 26 những năm 70 các nước phát triển bắt ựầu khai thác công nghệ này trong thương mại và ở các nước ựang phát triển bắt ựầu công nghệ nuôi cấy mô từ những năm 80[24] [25].
Theo Murashige (1974) có 300 loại cây trồng có thể nhân giống bằng phương pháp NCM. Có khoảng 600 công ty trên thế giới áp dụng phương pháp này ựể nhân 500 triệu cây giống/năm chủ yếu là giống hoa, cây cảnh, cây ăn quả, cây công nghiệp, cây rừng, và một số loại cây rau ( Vasil. 1944). Dự kiến thị trường cây giống nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy mô vào khoảng 15 tỷ USD/năm, tốc ựộ tăng trưởng hàng năm khoảng 15 % (Govil and Gupta). Riêng ở Ấn độ, năm 1998 cả nước mới chỉ có 4 cơ sở nuôi cấy mô với công suất 5 triệu cây/ năm, ựến năm 1996 ựã tăng lên là 75 công ty sản suất khoảng 190 triệu cây giống/năm. Nhiều công ty ựã ựi theo hướng chuyên môn hóa trong việc sản xuất giống hoa có giá trị kinh tế cao như hoa Lily, Loa Kèn, Cẩm chướng, Lan Hồ ựiệp, đai Châu, Hoàng Thảo, Vũ Nữ, địa Lan.
Theo R.Daniel Lineberger (1980) nuôi cấy mô là quá trình tách mô tế bào cây nuôi trong môi trường ựặc thù về dinh dưỡng, Hoocmoon và ánh sáng trong ựiều kiện vô trùng, trong ựiều kiện in vitro tạo ra số lượng lớn cây trong thời gian ngắn từ một cơ quan vô tắnh của cây mẹ.
Hudson T.Harmann và Dale ẸKester (1983) vi nhân giống là tạo ra các cây từ những phần rất nhỏ như mô hoặc tế bào phát triển vô trùng trong ống nghiệm hoặc bình chứa khác có môi trường và dinh dưỡng nhân tạọ Có sử dụng các cơ quan như thân, rễ, hoa, lá và phôi ựưa và nuôi cấy ựể tạo nên các mô, calluss, protocorm. được áp dụng nhiều trong nghiên cứu khoa học, nhất là trong lĩnh vực chọn tạo và nhân giống cây trồng.
Theo Gert Forkmann. R.Treutter (2005) khái niệm vi nhân giống ở thực vật là một quá trình tổng hợp trong ựó các tế bào, các mô hoặc cơ quan ựược chọn lọc của cây ựược tách ra, khử trùng bề mặt, nuôi cấy trong môi trường kắch thắch thắch sinh trưởng ựể tạo ra nhiều cây con vô tắnh (Altman,2000). Kỹ thuật nhân vô tắnh các tế bào ựơn nuôi cấy in vitro trong ựiều kiện phù
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 27 hợp tạo thành cây hoàn chỉnh, khả năng một tế bào sinh trưởng phát triển thành một cơ quan ựa bào gọi là tắnh toàn năng của tế bào (Razdan, 1993. Wetzstein & He, 2000). Tắnh toàn năng này của tế bào và mô có ở tất cả các tế bào là nguyên lý cơ bản cho nuôi cấy mô[38].
Việt Nam ựã thành công trong nhân giống nhiều loại cây trồng như cây lương thực, cây lâm nghiệp, hoa và cây cảnh. đã có rất nhiều công trình công bố thành công như Táo, đào, Mận, Khoai Tây, Khoai Lang sạch Virus, Hoa Hồng, hoa Chậu Thảm và ựặc biệt là hoa Lan trong ựó có địa Lan, Hoàng Thảo, Vũ Nữ, Hồ điệp, Cattleya, Vandạ.[30].
Nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô với nhiều mục ựắch khác nhau như nhân nhanh giống, nhân giống sạch bệnh, tăng hệ số nhân, nhân kiểu gen dị hợp. Nhiều cây trồng nhân giống in vitro ựã ựược thương mại ở Mỹ và Châu Âu với hàng trăm loài cây trồng khác nhau[30]. Nhân giống in vitro ở cây thuốc cũng thu ựược những kết quả cao ở trên 100 loài cây thuốc và cây nhân giống in vitro cho các hoạt chất tốt ựược N.Haq công bố năm 2000.
Nhân giống sử dụng nuôi cấy mô tế bào là tạo ra các cây giống chất lượng cao, ựồng nhất và là một phương pháp tạo ra các dòng vô tắnh sạch bệnh. Cây trồng ựầu tiên thương mại bằng phương pháp này là hoa Phong
Lan Cymbidium, sau ựó người ta sử dụng phương pháp này cho nhân giống
Khoai Lang, Khoai Tây sạch Virus, nhân giống hoa Tulip, Lilỵ Nuôi cấy mô tế bào cũng là một phương pháp hữu ắch tạo giống lai mới ở hoa Phong Lan và hoa Hồng [25][26].
1.8.2 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng ựến nuôi cấy mô hoa Lan
Theo các tác giả Duan-J.cs. (1996), Irving -H.R.(1992), Kukulczanka- K(1985), Mamaril - J(1996),(1997), Okamoto-T(1983), Nguyễn Quang Thạch và CS (2005), đỗ Năng Vịnh và CS(2009), Dương Tấn Nhựt (2007), môi trường có vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy, nó cung cấp chất dinh dưỡng ựảm bảo cho sự sinh trưởng của mô cấy, môi trường này khác nhau tùy thuộc vào từng loài, giống, thậm chắ các mô ựược lấy từ các cơ quan khác
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 28 nhau trên cùng một cơ thể sinh vật cũng có nhu cầu dinh dưỡng khác nhaụ Cho ựến nay người ta ựã tìm ựược nhiều môi trường dinh dưỡng cho nuôi cấy hoa Lan như : Môi trường dinh dưỡng cơ bản MS (Murashige - Shoog. 1962), môi trường VW (Vacin - Went.1949), môi trường Kc(Knudson C ), môi trường F (Fonnesbech 1972 ạb)Ầ các công thức môi trường có nhiều ựiểm khác nhau nhưng chúng thường gồm 4 thành phần cơ bản :
Nguồn Cacbon, nguồn muối khoáng, Vitamin và các Phytohormon, các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên. Nguồn Cacbon do các mô cấy hầu như không quang hợp, sự ựồng hóa chủ yếu là do hút các chất dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy (Debergh và CS 1991). Hàm lượng Chlorophyl trong mô nuôi cấy là một ựặc ựiểm hình thái phụ thuộc vào nguồn hydratcacbon (Bhojwani và Razdan 1983). đường Glucose là nguồn Cacbon thắch hợp cho mô cây một lá mầm (Tissue - D.T.1995). Ngoài chức năng cung cấp chất hữu cơ trong mô nuôi cấy, Cacbon còn ựóng vai trò như một chất tạo áp suất thẩm thấu (Widiastoety -D.1995).
Các muối khoáng: Là thành phần không thể thiếu ựược ựối với thực vật, chúng là những chất tham gia vào cấu thành những cơ quan tử của cơ thể thực vật. Vắ dụ như : Mg có trong thành phần phân tử Chlorophyl, Ca tạo nên thành tế bào, Zn, Fe có trong thành phần các EnzimẦ( Anderson1980). Theo hiệp hội các nhà sinh lý thực vật (IAPP), những muối khoáng mà thực vật cần có nồng ựộ lớn hơn 0,5mM/l ựược xếp vào nhóm muối khoáng ựa lượng, ựó là các nguyên tố N,P,S,K,Ca, Mg. Còn các loại muối khoáng mà thực vật cần nồng ựộ nhỏ hơn 0,5mM/l ựược xếp vào muối khoáng vi lượng, ựó là các nguyên tố Mn, Zn, Bo, Mo, Co, I, Cr ( Bhojwani và Razdan,1983).
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nitơ ựược sử dụng dưới dạng muối : CăNO3 )2 ; KNO3 ; NaNO3 ; NH4NO3, ựối với nhiều loại cây có hàm lượng NO3- tối thiểu bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ 20- 25 mM/l trong khi nồng ựộ NH4+ ựược dùng với hàm lượng nhỏ hơn 8 mM/l (Bhojwni và Razdan 1983). Hai dạng Photpho thường ựược dùng làm môi trường là Natri
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 29 photphat (NaH3PO4.7H2O) và Kaliphotphat(KH2PO4). Tùy thuộc vào mục ựắch nuôi cấy mà sử dụng nồng ựộ PO43-trong môi trường biến thiên từ 0,15 - 4 mM/l (Trần Văn Minh, 1994).
Hiện nay Sắt ựược ựưa vào dưới dạng Chelat kết hợp với Na2- Etylen - diamin tetra axetat(EDTA), ở dạng này Sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của thực vật ( Street. 1973). Các nguyên tố vi lượng chỉ chiếm 0,05% khối lượng nhưng lại ựóng vai trò sinh lý cực kỳ quan trọng. Nguyên tố vi lượng trong tế bào thực vật chủ yếu nằm dưới dạng phức hữu cơ khoáng, nó ựóng vai trò trong việc thúc ựẩy sự phát triển của thực vật trong giai ựoạn xuân hóa (Lê Văn Chi, 1992). để ựảm bảo cho việc sinh trưởng, phát triển bình thường của cây người ta ựưa tất cả các nguyên tố vi lượng vào trong môi trường nuôi cấy (Peirik, 1987).
Ngoài ra các Vitamin rất cần thiết, tuy nhiên với số lượng không ựầy ựủ. để mô nuôi cấy sinh trưởng, phát triển tối ưu người ta thường thêm vào môi trường một số Vitamin nhóm B như Tiamin (B1), Pyridoxin (B6),
Niconim axit (B3) và Canxium panthenate (B5) (Ghojwanị 1982).
Các Phytohormone có tác dụng ựiều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật. Cho ựến nay người ta ựã tìm ựược rất nhiều chất tự nhiên hoặc nhân tạo ảnh hưởng rất mạnh ựến sinh trưởng và phát triển của thực vật. Người ta chia các Phytohormon ra làm 5 nhóm chắnh : Auxin, Cytokinin, Gibberellin, Abscisic axit, Etylen (Nguyễn Văn Uyển.1993) (Strauss - MS ; arditti - J.1984). Khác với các hợp chất dinh dưỡng, các chất ựiều hòa sinh trưởng có tác dụng tạo nên sự phát sinh, hình thành mô in vitro ngay ở hàm lượng rất thấp 0-2mg/l. Theo Skoog và Miller(1987) dẫn theo Trần Văn Minh,1994). Sự biệt hóa cơ quan thực vật ựược quyết ựịnh bởi sự tương tác giữa 2 nhóm Phytohormon là Auxin và Cytokinin.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 30
1.8.3 Các chất ựiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô hoa Lan
Trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì việc ứng dụng các chất ựiều hòa sinh trưởng là hết sức quang trọng. Hai nhóm chất ựược sử dụng nhiều nhất là Auxin (là nhóm chất quyết ựịnh hình thành rễ) và Cytokinin (là nhóm quyết ựịnh hình thành chồi). để nhân nhanh in vitro, trong giai ựoạn ựầu cần phải ựiều khiển mô nuôi cấy phát sinh thật nhiều chồi ựể tăng hệ số nhân. Vì vậy người ta tăng nồng ựộ Cytokinin trong nuôi cấy[1].
Trong nuôi cấy mô thực vật Auxin ựược sử dụng ựể kắch thắch sự phân chia tế bào, biệt hóa rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi hoặc tạo rễ phụ [ 1]. Trong một số trường hợp, mẫu nuôi cấy có thể sản sinh ra Auxin ngoại sinh [11]. Các Hoocmon thuộc nhóm Auxin hay sử dụng là : α- NAA, IAA, IBA, 2,4D.
Theo các tác giả Chamchuree- Sottkul (1991), Ghojwani (1982) Cytokinin có tác dụng kắch thắch sự phân chia tế bào, phát sinh chồi nách, kìm hãm tắnh trội của chồi ựỉnh, tham gia ựiều hòa sinh trưởng ở tất cả các pha phát triển từ khi hạt nảy mầm ựến khi già. Sự có mặt của Cytokinin ựôi khi kìm hãm sự phát triển của rễ. Trong nhóm Cytokinin thì có 2 loại sau ựây là phổ biến nhất: Kinitine (6 Furfuryl aminopurin), BAP (6 Benzyl Amino Purin) là những Cytokinin hay ựược sử dụng với nồng ựộ trung bình 0,5 - 10 mg/l và ựược pha loãng trong HCl và NaOH. Người ta còn phát hiện ra Kinitine có nhiều trong Nước Dừa [24][30]
Theo Dương Tấn Nhựt và CS (2008) việc phối hợp giữa Auxin và Cytokinin có tác dụng hỗ trợ cho nhau ựể tái sinh cây hoàn chỉnh. Nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao sẽ kắch thắch mô phát sinh rễ, ngược lại ở tỷ lệ thấp sẽ phát sinh chồi, còn ở mức trung gian, mô sẽ sinh nhiều mô sẹọ Có khoảng 20 loại Hoocmon khác nhau thuộc nhóm Gibberenin nhưng chỉ có Gibberelic axid A3 (GA3) ựược sử dụng với mục ựắch kéo dài ựốt, kắch thắch sự sinh trưởng của chồi (Peirik. 1987). Gibberellin giúp cho các chồi ựỉnh phát sinh nhanh hơn hoặc biến các phôi vô tắnh thành câỵ nó cũng có thể phá ngủ các
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 31 phôi hoặc tách rời hạt. tác dụng ức chế, tạo rễ phụ và chồi phụ (Streẹ1973) Trong nuôi cấy người ta cũng sử dụng Abscisic axit (ABA) nó là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên thường ảnh hưởng âm tắnh lên mẫu cấy in vitrọ
Tuy nhiên người ta còn cho thêm các chất phụ gia vào môi trường nuôi cấy mô như nước Dừa, nước chiết dịch Men, nước Cà chua ép, dịch Khoai tây, dịch Chuối xanhẦ ựể kắch thắch sự phát triển của một số cơ quan thực vật trong quá trình nuôi cấy[22].
Công bố ựầu tiên về nước Dừa sử dụng trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và công sự, 1941,1942. và (George,1993,1996) ựược xác ựịnh là giầu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kắch thắch sinh trưởng, và ựược sử dụng ựể kắch thắch phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây trồng, dịch chiết của Cà chua, Cà rốt, Khoai tây, Chuối xanhẦ cũng ựược sử dụng trong nuôi cấy mô ựể làm tăng phát triển của mô sẹo hay các cơ quan nuôi cấy[23].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 32
CHƯƠNG 2: đỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 đối tượng nghiên cứu
- đối tượng nghiên cứu: Lan Hồ ựiệp Phát quang (Phalaenopsis sp.
Blume) và Lan Phượng vĩ (Renanthera coccinea Lour) ở thể protocorm.
Ảnh 2.1. Lan Hồ ựiệp Phát quang Ảnh 2.2. Lan Phượng vĩ
- Vật liệu nghiên cứu:
1) Thành phần môi trường nền Vacin and Went (1949) có bổ sung 20 gam đường saccarose + 7 gam Agar + 0,2 gam Than hoạt tắnh.
2) Một số chất ựiều tiết sinh trưởng như Benzyn Amino Purin (BAP), Kinitinee (Ki), α -Naphthalene Acetic Acid (α-NAA), Indol Butyric Acid (IBA).
3) Hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên như: Khoai Tây, Chuối Xanh, Cà rốt, Cà Chua, Nước Dừạ
4) Giá thể trồng cây là rong biển
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 33
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ựiều tiết sinh trưởng và các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên ựến hệ số nhân chồi của Lan Hồ ựiệp Phát quang và Lan Phượng vĩ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ựiều tiết sinh trưởng và các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên ựến sự tái sinh cây hoàn chỉnh của Lan Hồ ựiệp Phát quang và Lan Phượng vĩ
- Nghiên cứu kỹ thuật ra cây ngoài vườn ươm ựối với Lan Hồ ựiệp Phát quang và Lan Phượng vĩ
Các nội dung nghiên cứu ựược tóm tắt qua sơ ựồ sau:
Ị TẠO VẬT LIỆU KHỞI đẦU IỊ GIAI đOẠN NHÂN NHANH
Tập chung nghiên cứu các vấn ựề sau
1. Tác dụng của BAP 2. Tác dụng của Kinetin
3. Tác dụng của BAP và α- NAA 4. Tác dụng của Ki và α-NAA 5. Tác dụng của BAP và IBA 6. Tác dụng của Ki và IBA 7. Tác dụng của Khoai tây 8. Tác dụng của Chuối xanh 9. Tác dụng của Cà rốt 10. Tác dụng của Cà chua 11. Tác dụng của Nước dừa
12. Tác dụng của tổ hợp dịch Khoai Tây, Chuối Xanh, Cà Rốt, Cà Chua, Nước Dừạ IIỊ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH
1. Tác dụng của α-NAA 2. Tác dụng của IBA 3. Tác dụng của tổ hợp các hợp chất hữu cơ và α-NAA 4. Tác dụng của tổ hợp các hợp chất hữu cơ và IBA
IV. GIAI đOẠN VƯỜN ƯƠM 1. Ảnh hưởng của giá thể rong biển và phân bón Growmore (20:20:20) lên quá trình sinh trưởng.
Tạo cây hoàn chỉnh
Vườn ươm
12 thắ nghiệm
4 thắ nghiệm
1 thắ nghiệm đỉnh sinh trưởng của 2 giống
Nguồn vật liệu khởi ựầu (Protocorm)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 34
2.3.1 Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm bố trắ theo kiểu CRD, 3 lần nhắc lạị Lan Hồ ựiệp Phát quang trong giai ựoạn nhân nhanh mỗi lần nhắc là 5 cá thể và giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh mỗi lần nhắc là 10 cá thể. Lan Phượng vĩ trong giai ựoạn nhân nhanh và giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh là 10 cá thể trong một lần nhắc. Giai ựoạn vườn ươm theo dõi 30 cá thể trên 1 lần nhắc ựối với cả hai giống. Số