4.2.1. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA
(a) (b)
Hình 4.1. Kết quả điện di RNA tổng số
Chú thích: Hình 4.1.a không sử dụng DNase I trong quá trình ly trích. Hình 4.1.b có sử dụng DNase I trong quá trình ly trích
So sánh kết quả Hình 4.1.a và Hình 4.1.b ta thấy có sự khác biệt rất lớn giữa sử dụng DNase I và không sử dụng DNase I trong quá trình ly trích. Ở Hình 4.1.a sản phẩm RNA có rất nhiều tạp, tạp này có thể là DNA hoặc RNA của tế bào thực vật hoặc là cả hai bởi vì khi nhuộm trong ethium bromide thì cả DNA và RNA đều có thể phát sáng dƣới tia UV. Ngƣợc lại ở Hình 4.1.b sản phẩm RNA tƣơng đối sạch, có thể là DNase I đã phân giải phần lớn các phân tử DNA nên khi nhuộm với ethium bromide thì không còn đủ số lƣợng để phát sáng dƣới tia UV.
Khi so sánh kết quả Hình 4.1.a và Hình 4.1.b thì ta có thể khẳng định: Tạp trong quá trình ly trích RNA (không sử dụng DNase I) phần lớn là DNA tế bào thực vật. Vì khi sử dụng DNase I thì kết quả điện di không thấy xuất hiện tạp.
Kết quả ly trích RNA đã không đạt kết quả hoặc do lƣợng RNA quá ít nên không đủ để phát sáng.
4.2.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA
1 2 3 4
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA
Chú thích:
Giếng 1: thực hiện phản ứng reverse transcription với 2 µl RNA tổng số Giếng 2: thực hiện phản ứng reverse transcription với 3 µl RNA tổng số Giếng 3: thực hiện phản ứng reverse transcription với 4 µl RNA tổng số Giếng 4: thực hiện phản ứng reverse transcription với 5 µl RNA tổng số
Kết quả điện di cho thấy khi chạy phản ứng reverse transcription với các thể tích RNA tổng số lần lƣợt 2 µl, 3 µl, 4 µl và 5 µl đều không cho sản phẩm cDNA trên gel điện di. Điều này có thể do lƣợng RNA tổng số ly trích đƣợc quá ít nên khi chạy reverse transcription sản phẩm cDNA tạo ra quá ít nên không phát sáng dƣới tia UV sau khi nhuộm ethium bromide, hoặc cũng có thể là quá trình reverse transcription đã không thành công.
4.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Chúng tôi đã tiến hành Blast trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và thu đƣợc kết quả là cả 2 cặp mồi L1, L2 và P28, M6 đều chỉ bắt cặp đặc hiệu với virus TSWV
dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds.
Length=8897
4.2.4. Kết quả phản ứng RT – PCR 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc
Sau khi thay đổi hầu hết các thông số phản ứng, kết quả chạy RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả dƣơng tính với virus TSWV, chúng tôi đƣa ra nhận định sau:
Kết quả ly trích RNA đã không thành công
Do quá trình tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành với mồi ngẫu nhiên hay mồi Oligo (dT) nên đôi khi không tạo ra sản phẩm là các đoạn gen cần khuếch đại.
Hàm lƣợng RNA tổng số quá thấp đến việc cDNA đƣợc tạo ra rất ít. Trong khi đó chúng ta chỉ sử dụng một lƣợng nhỏ sản phẩm cDNA để chạy PCR nên không cho kết quả dƣơng tính.
4.2.4.2. Phản ứng RT – PCR một bƣớc
Sau khi phản ứng RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả chúng tôi đã tiến hành chạy thử nghiêm quy trình RT – PCR một bƣớc với cặp mồi L1, L2và đã cho kết quả nhƣ sau:
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm RT – PCR một bƣớc
Chú thích: L: Ladder
Từ kết quả trên ta thấy bên cạnh băng sản phẩm (276 bp) có xuất hiện băng sản phẩm phụ khoảng 140 bp. Điều này có thể do:
Nồng độ MgCl2 quá cao (2 mM) nên ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu của mồi. Nhiệt độ bắt cặp thấp (500C) so với Tm của mồi lần lƣợt là 53,70C và 56,50C làm giảm độ đặc hiệu của mồi.
Nồng độ Taq polymerase cao (2,5 U) cũng làm tăng mức độ tạp của sản phẩm RT – PCR.
Do điều kiện hạn chế của đề tài, ban đầu chúng tôi chỉ chuẩn bị hóa chất để chạy RT – PCR hai bƣớc nên chúng tôi chƣa có đủ điều kiện để tối ƣu, phản ứng RT – PCR một bƣớc chỉ dừng lại mức thử nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận định chung
Sau khi kết hợp kết quả phản ứng ELISA, phản ứng RT – PCR một bƣớc và phản ứng RT – PCR hai bƣớc có thể kết luận có hai nguyên nhân làm phản ứng RT – PCR không ra kết quả:
Phản ứng tạo cDNA đã không tạo ra sản phẩm chứa đoạn gen mong muốn. Hàm lƣợng RNA tổng số quá ít nên khi sử dụng lƣợng nhỏ (2 – 5 µl) để tổng hợp cDNA, sau đó lại chỉ dùng 2 µl trong tổng số 20 µl sản phẩm cDNA để chạy PCR. Nhƣ vậy lƣợng cDNA hút đƣợc để tiến hành PCR là rất ít hoặc có thể không có.
276 bp
Phần tạp L
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Sau khi tiến hành chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công thuộc tỉnh Tiền Giang chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Tỉ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra Xã Hòa Định: 12,0 %
Xã Bình Ninh: 13,16 % Xã Bình Nhì: 14,29 % Xã Thạnh Nhật: 10,0 %
Tỉ lệ nhiễm theo triệu chứng trung bình trong tỉnh là 60,0 %
Chƣa xây dựng đƣợc quy trình RT – PCR hai bƣớc chẩn đoán TSWV. Bƣớc đầu tìm ra đƣợc quy trình RT – PCR một bƣớc chẩn đoán bệnh TSWV, tuy nhiên cần tối ƣu một vài thông số để đạt hiệu quả tốt hơn.
5.2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu mức độ gây hại theo giống, theo độ tuổi và theo các thời điểm khác nhau trong năm. Đặc biệt nghiên cứu khả năng lây nhiễm TSWV trên các đối tƣợng khác.
Kết hợp sử dụng cây chỉ thị chẩn đoán sớm bệnh TSWV trên đồng ruộng. Tiếp tục xây dựng quy trình RT – PCR hia bƣớc chẩn đoán TSWV.
Dù quy trình RT – PCR một bƣớc cho ra sản phẩm nhƣng kết quả vẫn còn tạp. Chúng tôi đề nghị thay đổi các thông số về nhiệt độ, thời gian, số chu kì, hóa chất (Taq polymerase, MgCl2,MgCl2, primer) lƣợng RNA khuôn mẫu…. để kết quả tốt hơn.
Đối với phản ứng RT – PCR hai bƣớc để khắc phục trƣờng hợp hàm lƣợng RNA tổng số quá ít nên xây dựng quy trình Nested – PCR.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Mai Thị Phƣơng Anh, Trần Văn Lài và Trần Khắc Thi, 1996. Rau và trồng rau (giáo trình cao học nông nghiệp). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 254 trang
2. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003. Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng (quyển 2: cây thực phẩm). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 596 trang
3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2005. Sinh học phân tử (Giới thiệu phương pháp và ứng dụng). Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 238 trang
4. Tạ Thu Cúc, 1999. Kỹ thuật trồng cà chua. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.Hồ Chí Minh, Việt Nam. 104 trang
5. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp – Ứng dụng). Tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 301 trang
6. Lâm Ngọc Hạnh, 2005. Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quá trình chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 114 trang
7. Nguyễn Thị Lan, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 219 trang 8. Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi, 2004. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng. Nhà
9. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 103 trang.
10. Nguyễn Đình Trƣờng, 2005. Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 85 trang
11. Khoa Nông Học, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 2006. Giáo trình cây rau. 175 trang
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
12. Craig H. Canaday, 2007. Tomato spotted wilt virus (TSWV) information and control strategies. Dept of Entomology and Plant Pathology, The University of Tennessee, West Tennessee Research and Education Center (WTREC) Jackson, Tennessee. 8 pages (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
13. Sonya Broughton, Roger Jones and Brenda Coutts, 2004. Management of thrips and tomato spotted wilt virus. Farmnote No. 69/2004. 4 pages
14. M.J. McPherson and S.G. Moller, 2000. PCR. BIOS Scientific Publishers Ltd. Chapter 3/p 23 – 59
15. Paul Maris, 2004. Evaluation of thrips resistance in pepper to control Tomato spotted wilt virus infection. Thesis Wageningen University – with references – with summary in Dutch. ISBN 90 – 8504 – 002 – 7. 120 pages
16. J.Morris, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, Y041 1LZ, UK.
Protocol for the diagnosis of quarantine organisms. 35 pages
17. H. D. Shew and G. B. Lucas, 1990. Compendium of Tobacco disease. APS PRESS. 67 pages
18. College of Agricultural & Environmental Sciences, 2005. Tospoviruses In Solanaceae and Other Crops in The Coastal Plain of Georgia. Research report number 704, december, 2005.40 pages
19. Introduction to Antibodies – Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA). <http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp#General>
20. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay).
<http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=3097> INTERNET 21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 22. http://www.promega.com. 23. http://agdia.com/cgi_bin/catalog.cgi/39300. 24. http://www.apsnet.org/journals 25. http://docsach.dec.vn/noidung/55359.dec
PHỤ LỤC
Phụ lục 1
Phụ lục 2
Kết quả blast với cặp mồi L1, L2
Distance tree of results
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident Links AB190813.1
Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete
sequence
37.4 37.4 34% 3.3 100%
AY070218.1
Tomato spotted wilt virus RNA- dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds 37.4 37.4 34% 3.3 100% D10066.1
Tomato spotted wilt virus L RNA
encoding RNA polymerase, complete cds
37.4 74.7 68% 3.3 100%
dbj|AB190813.1| Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete
sequence Length=8917
Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 |||||||||||||||||||| (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gb|AY070218.1| Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene,
complete cds Length=8640
Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 ||||||||||||||||||||
Sbjct 4100 ATCAGTCGAAATGGTCGGCA 4119
dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding
RNA polymerase, complete cds
Length=8897
Sort alignments for this subject sequence by:
E value Score
Percent identity
Query start
position Subject start position
Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 ||||||||||||||||||||
Sbjct 4121 ATCAGTCGAAATGGTCGGCA 4140
Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Minus
Query 1 AATTGCCTTGCAACCAATTC 20 ||||||||||||||||||||
Phụ lục 3
Kết quả blast với cặp mồi P28, M6
Distance tree of results
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident Links AY070218.1
Tomato spotted wilt virus RNA- dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds 44.6 44.6 43% 0.020 100% D10066.1
Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds 44.6 81.9 80% 0.020 100% AB198742.1
Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds
39.2 39.2 43% 0.83 95% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
AB190813.1
Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete
sequence
gb|AY070218.1| Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene,
complete cds Length=8640
Score = 44.6 bits (48), Expect = 0.020 Identities = 24/24 (100%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus
Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 ||||||||||||||||||||||||
Sbjct 4698 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 4675
dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding
RNA polymerase, complete cds
Length=8897
Sort alignments for this subject sequence by:
E value Score
Percent identity
Query start
position Subject start position
Score = 44.6 bits (48), Expect = 0.020 Identities = 24/24 (100%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus
Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 ||||||||||||||||||||||||
Sbjct 4723 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 4700
Score = 37.4 bits (40), Expect = 2.9
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 AGAGTGATCCATCGGAAGCC 20 ||||||||||||||||||||
Sbjct 3977 AGAGTGATCCATCGGAAGCC 3996
dbj|AB198742.1| Tomato spotted wilt virus gene for L protein,
complete cds Length=8913
Score = 39.2 bits (42), Expect = 0.83 Identities = 23/24 (95%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||| |||||
> dbj|AB190813.1| Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence
Length=8917
Score = 39.2 bits (42), Expect = 0.83 Identities = 23/24 (95%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||| ||||| Sbjct 4734 GCAATAGAGAGGAATAATTGCTCC 4711 Phụ lục 4 Thành phần hóa chất phản ứng RT – PCR một bƣớc đã chọn Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút M – MLV buffer 5X 1X 5 µl dNTPmix 10 mM 0,2 mM 0,5 µl Primer 1 10 µM 0,4 µM 1 µl Primer 2 10 µM 0,4 µM 1 µl MgSO4 25 mM 2 mM 2 µl M - MLV reverse transcriptase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DNA polymerase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl
RNA tổng số 2 – 5 µl
Nuclease free
water Thêm vào đủ 25 µl
Phụ lục 5
PHIẾU ĐIỀU TRA
Mã số ...
Nơi lấy mẫu ...
Chủ hộ ... Giống cây ... Tuổi cây ... Tình trạng vƣờn ... Cách trồng ... Độ thuần ... Diện tích trồng ... Năng suất ... Mùa vụ ... Bệnh có thƣờng xảy ra không ... Triệu chứng ...