Nghiên cứu về virus nói chung và TSWV nói riêng còn khá mới, chủ yếu là những nghiên cứu ở các trƣờng Đại học.
Nguyễn Ngọc Bích, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM (2003) bƣớc đầu nghiên cứu một số bệnh virus (TSWV, CMV, TMV) bằng kỹ thuật DAS – ELISA.
Trần Thị Thu Hà, trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. HCM (2005) điều tra bệnh TSWV trên cây thuốc lá trong vƣờn nhân giống cây con tại tỉnh Tây Ninh.
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian tiến hành nghiên cứu từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007.
Địa điểm lấy mẫu: lấy mẫu cà chua có triệu chứng bệnh TSWV tại tỉnh Tiền Giang tiến hành thu mẫu và trữ ở -200C cho đến khi phân tích.
Việc phân tích đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trƣờng (RIBET), Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị 3.2.1.1. Dụng cụ Cối, chày sứ Lọ đựng hóa chất Eppendorf Hộp đựng đầu tip Micropipette Đầu tip
Đĩa ELISA (microplates) 96 giếng Ống đong
Khay đổ gel
Bồn chứa ethium bromide
3.2.1.2. Máy móc, thiết bị Máy cất nƣớc Máy cất nƣớc Cân phân tích Máy li tâm Tủ cấy Tủ mát Tủ định ôn Bồn ủ nhiệt Máy rửa ELISA Bồn ủ ELISA Máy đọc ELISA
Máy vortex (IKA Works) Máy PCR
Lò viba (Electrolux) Máy điện di
Máy đọc gel
3.2.2. Hoá chất
3.2.2.1. Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA
Sử dụng kit ELISA do Agdia cung cấp gồm các thành phần sau: Dịch trích mẫu (SEB1 extract buffer 1X)
Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer) Kháng thể (Capture antibody)
Dịch rửa (PBST wash buffer) Đối chứng dƣơng (Positive control) Đối chứng âm (Negative control)
Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (ECI enzyme conjugate buffer)
Kháng thể gắn enzyme alkaline – phosphatase (Conjugate antibodies) Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu (PNP substrate buffer)
Chất chỉ thị màu p – NPP Ngoài ra còn sử dụng thêm:
Cồn 70%
Nƣớc cất hai lần khử ion và hấp khử trùng
3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR
Hóa chất dùng trong ly trích RNA: sử dụng kit ly trích SV total RNA Isolation System do Promega cung cấp. Những hóa chất có sẵn trong kit:
Dịch trích mẫu (RNA lysis buffer)
Dịch pha loãng RNA (RNA dilution buffer) Dịch rửa (RNA wash solution)
DNase I dạng bột DNase stop solution (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dịch pha loãng DNase I (Yellow core buffer và MnCl2) Nuclease free water
Bên cạnh đó cần sử dụng thêm các hoá chất đã có sẵn trong phòng thí nghiệm: β – mercaptoethanol 14,2 M
Ethanol 95 – 100 % NaOH 0,1 M
EDTA 1M
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Hóachất dùng chạy RT – PCR
RT – PCR một bƣớc
Reverse transcription 10X buffer MgSO4, 25 mM
dNTP mix, 10 mM
Taq DNA polymerase Primer xuôi
Primer ngƣợc RNasin
Nuclease free water RT – PCR hai bƣớc
Dùng tạo cDNA: sử dụng kit tổng hợp cDNA (Reverse transcription system) do Promega cung cấp với các thành phần sau:
AMV reverse transcriptase
Recombinant RNasinR ribonuclease inhibitor Oligo(dT)15 primer (0,5 µg/µl)
Radom primers (0,5 µg/µl)
1,2 kb kanamycin positive control RNA (0,5 µg/µl) dNTP mix, 10 mM
Reverse transcription 10X buffer MgCl2, 25 mM
Nuclease free water
Hoá chất sử dụng phản ứng PCR: do Promega cung cấp gồm có: Green GoTaq flexi bufer 5X
MgCl2 (25 mM) dNTPmix (10 mM)
GoTag DNA polymerase (0,5 U/µl)
Nƣớc không chứa nuclease (Nuclease – free water) Primer:
Cặp mồi 1:
L1 (4377 – 4396) R 5’ – AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC – 3’ Tm = 53,7 L2 (4121 – 4140)F 5’ – ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA – 3’ Tm = 56,5
Cặp mồi 2 :
P28 (3977 – 3996) 5’ – AGA GTG ATC CAT CGG AAG CC – 3’ Tm = 54
M6 (4700 – 4723) 5’ – GCA ATA GAG AGG AAT AAT CGC TCC – 3’ Tm = 55
Hóa chất sử dụng trong điện di
Agarose TAE 0,5X Loading dye Ethium bromide Ladder
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung nghiên cứu 3.3.1. Nội dung nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy mẫu cà chua có triệu chứng TSWV tại tỉnh Tiền Giang để tiến hành phân tích.
Tiến hành phản ứng ELISA với mẫu bệnh thu đƣợc.
Thống kê và so sánh tỉ lệ nhiễm TSWV giữa các vùng lấy mẫu thông qua kết quả ELISA.
Lấy mẫu ELISA có biểu hiện dƣơng tính mạnh khảo sát nhằm tìm ra quy trình RT – PCR phù hợp.
3.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
Do đặc tính cà chua đƣợc trồng rất phổ biến tại Tiền Giang nên việc lấy mẫu đƣợc tiến hành bằng cách liên hệ trực tiếp với hộ dân trồng cà chua. Tùy theo diện tích vƣờn trồng có thể lấy từ 10 – 15 mẫu, cách lấy mẫu theo sơ đồ bố trí lấy mẫu ở bảng 3.1, những mẫu còn lại đƣợc lấy một cách ngẫu nhiên. Lấy mẫu lá cà chua ở phần ngọn có triệu chứng bệnh TSWV trữ ở -200C cho đến khi tiến hành nghiên cứu (số lƣợng mẫu tùy vào số lƣợng thí nghiệm có thể tiến hành). Lấy mẫu cà chua không quá non và cũng không quá già.
Bảng 3.1. Sơ đồ bố trí lấy mẫu
1 3
5
2 4
Số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm
Bảng 3.2. số lƣợng mẫu và vị trí lấy mẫu
Tỉnh Huyện Xã Số lƣợng mẫu Tiền Giang Chợ Gạo Hòa Định 25 Bình Ninh 38 Gò Công Bình Nhì 42 Thạnh Nhật 30 Tổng số lƣợng mẫu 135 3.3.3. Phƣơng pháp phát hiện TSWV 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA
Tiến hành theo hƣớng dẫn của protocol của kit ELISA
Lấy 0,5 g mẫu trữ ở -200C cho vào cối thêm 2,5 ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn, sau đó đổ vào eppendorf và ghi ký hiệu thật cẩn thận.
Đem ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 40C. Dùng micropipette hút phần dịch nổi sang một eppendorf mới và cũng ghi nhãn cẩn thận, trữ ở 40
C
Các bƣớc tiến hành:
Bƣớc 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí theo hƣớng dẫn của Kit
Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H
BF: ex tract buffer 1; 2…; 27: Số thứ tự của mẫu PC (Positive control) : Đối chứng dƣơng
NC (Negative control): Đối chứng âm Substrate: chỉ load nƣớc cất
Bƣớc 2: pha dịch đệm pha loãng kháng thể, pha loãng kháng thể 1/200, sau đó cho 100 µl kháng thể vào cột 2 – 11, dán băng keo và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ.
Bƣớc 3: rửa 3 lần với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa.
Bƣớc 4: cho nƣớc cất vào cột số 1(100 µl/giếng), cho đối chứng dƣơng và đối chứng âm vào 2 ô PC và 2 ô NC (100 µl/giếng), dịch nghiền mẫu (100 µl/giếng) vào ô từ 1 – 27. Đem ủ ở 40C qua đêm
Bƣớc 6: pha dung dịch đệm pha loãng kháng thể, pha loãng kháng thể có gắn enzyme 1/200. Hút 100 µl dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đó đem ủ ở 370C trong 2 giờ.
Bƣớc 7: rửa lại 3 lần với PBS – T
Bƣớc 8: hoà tan pNPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1 mg/ml của pNPP. Hút 100 µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 370
C trong 30 phút
Bƣớc 9: đọc kết quả bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ.Trong đó, giá trị và biện luận của test ELISA đƣợc tính thông qua các giá trị đo OD của buffer, các đối chứng dƣơng, âm và của mẫu sau khi đã trừ đi giá trị OD của các giếng substrate (các giai đoạn đầu đƣợc phủ bằng nƣớc cất). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
OD mẫu = OD đọc đƣợc – OD của giếng substrate
Giá trị OD này của mẫu sẽ đƣợc so sánh với một giá trị gọi là ngƣỡng (với ngƣỡng = hai lần giá trị OD trung bình của đối chứng âm)
Kết quả:
POS – đƣợc đánh giá là nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt xa ngƣỡng NEG – đƣợc đánh giá là không nhiễm bệnh khi giá trị OD của mẫu dƣới ngƣỡng.
Ngoài ra, còn có thể đọc kết quả bằng mắt thƣờng thông qua sự tạo màu có thể nhìn thấy đƣợc của substrate bị thủy phân bởi enzyme:
Màu vàng tƣơng ứng với kết quả dƣơng tính. Không màu tƣơng ứng với kết quả âm tính.
Tuy nhiên phƣơng pháp này độ tin cậy không cao so với việc đọc kết quả bằng máy.
3.3.3.2. Phƣơng pháp RT – PCR
Các mẫu có biểu hiện dƣơng tính mạnh với kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọn để tiến hành phản ứng RT – PCR. Kỹ thuật RT – PCR đƣợc chia ra làm 2 dạng: RT – PCR một bƣớc (quá trình tạo cNDA và quá trình PCR diễn ra trong cùng 1 phản
ứng), RT – PCR hai bƣớc (quá trình tạo cDNA và quá trình PCR diễn ra trong 2 phản ứng riêng biệt).
Ly trích RNA
Quá trình ly trích RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit ly trích RNA (SV total RNA isolation system). Tuy nhiên ta phải chuẩn bị trƣớc một số dụng cụ và hóa chất sau:
Nƣớc phải đƣợc xử lý với DEPC để khử RNase. Cối chày phải đƣợc hấp khử trùng sau khi đã đƣợc tráng nƣớc có chứa DEPC.
Đầu tip, eppendorf phải đƣợc xử lý sao cho đảm bảo vô trùng và không còn sự hiện diện của enzyme phân hủy RNA.
Pha DNase I từ dạng bột thành dạng lỏng Pha RNA lysis buffer
Pha RNA wash solution Pha DNA stop solution Tris base pH = 7,5 Ethanol 70 %, 100 % β – mercaptoethanol
Các bƣớc tiến hành ly trích RNA
1. Cân khoảng 30 mg mẫu lá có biểu hiện dƣơng tính với phản ứng ELISA, cắt ra từng miếng nhỏ (< 5 mm). Nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền.
2. Cho 30 mg mẫu đã nghiền vào eppendorf 1,5 ml có nắp đậy. cho 175 µl RNA lysis buffer (đã bổ sung β – mercaptoethanol) vào eppendorf.
3. Thêm 350 µl RNA dilution buffer, trộn đều và ly tâm với tốc độ 12000 vòng ở 40
C trong 10 phút. Hút dịch nổi sang eppendorf 1,5 ml.
4. Cho 200 µl ethanol 95 % vào eppendorf chứa dịch nổi, trộn bằng pipet 3 – 4 lần.
5. Hút dịch mẫu cho vào Spin Column Assembly (có trong kit). Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi Collection tube.
6. Cho 600 µl RNA wash solution (đã bổ sung ethanol 95 %) vào Spin Column Assembly. Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới.
7. Pha DNase I dạng bột với 275 µl Nuclease free water
8. Pha 5 µl DNase I + 40 µl yellow core buffer + 5 µl MnCl2. Cho 50 µl dung dịch DNase vào Spin Column Assembly, trộn đều bằng pipet.
9. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm 200 µl DNase stop solution (đã bổ sung ethanol 95 %). Ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C.
10.Thêm 600 µl RNA wash solution. Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới.
11.Thêm 250 µl RNA wash solution vào Spin Column Assembly, ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 2 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới.
12.Chuyển Spin Column Assembly sang Elution tube 1,5 ml ( có trong kit). 13.Thêm 100 µl Nuclease free water vào Spin Column Assembly, ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
14.Loại bỏ Spin Column Assembly, trữ Elution tube có chứa RNA ở -700
C. Mẫu RNA ly trích đƣợc dùng làm nguyên liệu tiến hành chạy RT – PCR một bƣớc hoặc tổng hợp cDNA để chạy RT – PCR hai bƣớc.
Kiểm tra sản phẩm RNA bằng điện di
Lấy mẫu RNA vừa ly trích (có sử dụng DNase I và không có sử dụng DNase I) tiến hành điện di trên gel agarose 1 %. So sánh kết quả đạt đƣợc.
RT – PCR một bƣớc Bảng 3.4. Thành phần hóa chất RT – PCR một bƣớc Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút M – MLV buffer 5X 1X 5 µl dNTPmix 10 mM 0,2 mM 0,5 µl Primer 1 10 µM 0,4 µM 1 µl Primer 2 10 µM 0,4 µM 1 µl MgSO4 25 mM 2 mM 2 µl M - MLV reverse transcriptase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl
DNA polymerase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl
RNA tổng số 2 – 5 µl
Nuclease free
water Thêm vào đủ 25 µl
Tổng thể Tích 25 µl
(Nguồn: Febbraio và Giugno, 2002) Chu kỳ nhiệt 1 chu kỳ: 480C trong 45 phút 940C trong 2 phút 45 chu kỳ: 940C trong 30 giây 500C trong 1 phút 720C trong 2 phút 1 chu kỳ: 720C trong 10 phút Giữ ở 40C
RT – PCR 2 bƣớc:
Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA.
Quá trình tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của bộ kit (Reverse Transcription System). Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau:
Thể tích RNA tổng số tiến hành thí nghiệm là 2, 3, 4, 5 µl
Primer sử dụng trong phản ứng tạo cDNA là Oligo(dT)15 primer và radom hexanucleotide primer
Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tổng hợp cDNA
Chu kỳ nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA
Đối với Oligo(dT)15 primer 420C trong 15 phút 940C trong 5 phút Giữ ở 40C
Thành phần Thể tích hút
MgCl2 (25 mM) 4 µl
Reverse Transcription buffer (10X) 2 µl
dNTPmix (10 mM) 2 µl
Recombinant RNasin ribonuclease
inhibitor 0,5 µl
AMV Reverse Transcription 1 µl Oligo(dT)15 Primer or Radom
primer 4 µl
Total RNA 2 – 5 µl
Nuclease free water Thêm vào cho đủ 20 µl
Đối với radom hexanucleotide primer Ủ nhiệt độ phòng 10 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
420C trong 15 phút 940C trong 5 phút Giữ ở 40C
cDNA đƣợc tổng hợp (20 µl) có thể đem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc trữ ở -20 0 C để chạy PCR sau. Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR Bảng 3.6. Thành phần hoá chất PCR Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút Green GoTaq flexi buffer 5X 1X 10 µl MgCl2 25 mM 1,5 mM 3 µl dNTP mix 10 mM 0,2 mM 1 µl GoTaq DNA polymerase 5 U/ µl 1,25 U 0,25 µl Primer L1 10 µM 1 µM 5 µl Primer L2 10 µM 1 µM 5 µl cDNA 2 µl Nuclease free water 23,75 µl Tổng thể tích 50 µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng
1 chu kỳ 5 phút ở 940C 30 chu kỳ 1 phút ở 940C 1 phút ở 550 C 1 phút ở 720 C
1 chu kỳ 10 phút ở 720
C Giữ ở 4oC trong 15 phút
Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình tiến hành chúng tôi thấy không cho kết quả nên đã có một số thay đổi để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau:
Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 550C xuống 530
C, 520C; 500C
Hạ nhiệt độ bắt cặp kết hợp với tăng chu kỳ từ 30 chu kỳ lên 35 chu kỳ; 40 chu kỳ
Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ mồi từ 1 µM lên 2 µM, 3 µM
Tăng nồng độ MgCl2 từ 1,5 mM lên 2 mM; 2,5 mM Tăng nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25 U lên 1,5 U Hạ nhiệt độ bắt cặp xuống 520
C, 530C; kết hợp tăng chu kỳ lên 40; tăng nồng độ mồi 2 µM; tăng nồng độ MgCl2 2 mM; tăng nồng độ Taq DNA polymerase 1,5 U.
3.3.3.3. Đổ gel điện di
Chuẩn bị gel agarose 1 % 2 %.
Agarose đã đƣợc nấu ở 650 W trong 1,5 phút, đổ vào khuôn đã chèn lƣợc để tạo giếng cho gel.
Khi gel đông lấy lƣợc ra, ngâm gel trong dung dịch TAE 0,5X. Hút 2 μl loading dye trộn đều với 4 μl mẫu PCR.
Bơm cẩn thận 6 μl hỗn hợp mẫu và loading dye vào giếng.
Chạy điện di: hiệu điện thế 50 V, cƣờng độ dòng điện 250 mA, trong 60 phút.
Lấy gel ra, nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (1 %) trong 20 phút. Rửa gel
Đọc kết quả bằng máy đọc gel Chụp hình gel để lƣu lại.
Kết quả phản ứng PCR dƣơng tính :
Có băng 276 bp đối với cặp mồi L1, L2 Có băng 704 bp đối với cặp mồi P28, M6
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA
4.1.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo
Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định thuộc huyện Chợ Gạo
Xã Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%)
Hòa Định 25 3 12,0 Bình Ninh 38 5 13,16 12,00 13,16 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 HÒA ĐỊNH BÌNH NINH XÃ TỈ LỆ (%)
Qua kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo tƣơng đối thấp, cụ thể nhƣ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xã Hòa Định 12,0 %