Chuẩn bị gel agarose 1 % 2 %.
Agarose đã đƣợc nấu ở 650 W trong 1,5 phút, đổ vào khuôn đã chèn lƣợc để tạo giếng cho gel.
Khi gel đông lấy lƣợc ra, ngâm gel trong dung dịch TAE 0,5X. Hút 2 μl loading dye trộn đều với 4 μl mẫu PCR.
Bơm cẩn thận 6 μl hỗn hợp mẫu và loading dye vào giếng.
Chạy điện di: hiệu điện thế 50 V, cƣờng độ dòng điện 250 mA, trong 60 phút.
Lấy gel ra, nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (1 %) trong 20 phút. Rửa gel
Đọc kết quả bằng máy đọc gel Chụp hình gel để lƣu lại.
Kết quả phản ứng PCR dƣơng tính :
Có băng 276 bp đối với cặp mồi L1, L2 Có băng 704 bp đối với cặp mồi P28, M6
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA
4.1.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo
Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định thuộc huyện Chợ Gạo
Xã Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%)
Hòa Định 25 3 12,0 Bình Ninh 38 5 13,16 12,00 13,16 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 HÒA ĐỊNH BÌNH NINH XÃ TỈ LỆ (%)
Qua kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo tƣơng đối thấp, cụ thể nhƣ sau:
Xã Hòa Định 12,0 % Xã Bình Ninh 13,16 %
Nhận xét: tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã khảo sát thuộc huyện Chợ Gạo là tƣơng đƣơng nhau. Nhƣ vậy có thể kết luận rằng bệnh TSWV chƣa chỉ phân tán rải rác tại huyện Chợ Gạo, bệnh không tập trung tại một địa điểm nhất định và chƣa phát thành đại dịch tại đây
4.1.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc thị xã Gò Công
Bảng 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công
Xã Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%)
Bình Nhì 42 6 14,29 Thạnh Nhật 30 3 10,0 10,00 14,29 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 BÌNH NHÌ THẠNH NHẬT XÃ TỈ LỆ (%)
Kết quả trên cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV hai xã khảo sát thuộc thị xã Gò Công cũng tƣơng đối thấp, cụ thể nhƣ sau:
Xã Bình Nhì 14,29 % Xã Thạnh Nhật 10,0 %
Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV tại xã Bình Nhì cao hơn xã Thạnh Nhật, tuy nhiên sự khác biệt là không đáng kể . Điều này đã nói lên một điều là TSWV cũng xảy ra rải rác tại thị xã Gò Công, bệnh chƣa đủ điều kiện phát triển thành đại dịch ở thời điểm khảo sát.
4.1.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công Bảng 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công Bảng 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công
Địa bàn Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%)
Huyện Chợ Gạo 63 8 12,7 Thị xã Gò Công 72 9 12,5 Tổng 135 17 12,6 12,70 12,50 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 H.CHỢ GẠO TX.GÒ CÔNG ĐỊA BÀN TỈ LỆ (%)
Thông qua kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm TSWV ở huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công là ngang nhau. Nhƣ vậy từ kết quả ELISA đã phần nào cho chúng ta biết tình hình nhiễm TSWV tại tỉnh Tiền Giang là không cao, trung bình khoảng 12,6 %.
Bệnh TSWV chƣa phát triển thành dịch một phần là do ảnh hƣởng của điều kiện tự nhiên nơi đây buộc ngƣời dân nơi đây xuống giống đồng loạt, ngƣời dân thƣờng xuyên sử dụng thuốc diệt công trùng, ngƣời dân đã biết phủ bạt để hạn chế dịch bệnh, cộng thêm vào đó là ngƣời dân thay đổi các loại cây trồng khác nhau, vệ sinh đồng ruộng nên virus không có cây kí chủ quanh năm, nhƣng không đƣợc chủ quan bởi vì với sự phát tán rộng rãi của virus này là nguy cơ tìm ẩn rất nguy hiểm, có thể bùng phát thành đại dịch bất cứ lúc nào nếu không có biện pháp quản lý phù hợp.
Tỉ lệ nhiễm TSWV theo độ tuổi và theo giống rất khó xác định vì: Thời điểm xuống giống tại địa bàn điều tra là đồng loạt nhau Đối với tên giống cây thì ngƣời dân rất ít quan tâm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1.4. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng
Qua đánh giá khách quan có thể ƣớc tính tỉ lệ nhiễm TSWV tại tỉnh Tiền Giang là khoảng 60 %. So sánh tỉ lệ nhiễm bệnh qua triệu chứng và kết quả ELISA ta thấy có điều bất hợp lý là tỉ lệ nhiễm TSWV qua triệu chứng cao hơn nhiều so vơi kết quả ELISA (cao gấp 2,6 lần). Tuy nhiên không thể chỉ dựa vào điểm này mà kết luận phƣơng pháp ELISA không chính xác, bởi vì nguyên tắc phản ứng ELISA dựa vào sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể nên có độ đặc hiệu và độ tin cậy rất cao.
Từ kết quả trên cho thấy không thể chỉ dựa vào triệu chứng để kết luận tỉ lệ nhiễm bệnh đƣợc. Bởi vì trên cây trồng có rất nhiều bệnh khác nhau, triệu chứng của chúng tƣơng tự nhau, thêm vào đó sự tƣơng tác giữa các bệnh có thể tạo ra những triệu chứng của bệnh khác. Ngoài ra, triệu chứng bệnh dƣới điều kiện môi
trƣờng khác nhau thì sẽ biểu hiện thành những triệu chứng khác nhau rất khó nhận biết.
4.2. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật RT – PCR 4.2.1. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA 4.2.1. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA
(a) (b)
Hình 4.1. Kết quả điện di RNA tổng số
Chú thích: Hình 4.1.a không sử dụng DNase I trong quá trình ly trích. Hình 4.1.b có sử dụng DNase I trong quá trình ly trích
So sánh kết quả Hình 4.1.a và Hình 4.1.b ta thấy có sự khác biệt rất lớn giữa sử dụng DNase I và không sử dụng DNase I trong quá trình ly trích. Ở Hình 4.1.a sản phẩm RNA có rất nhiều tạp, tạp này có thể là DNA hoặc RNA của tế bào thực vật hoặc là cả hai bởi vì khi nhuộm trong ethium bromide thì cả DNA và RNA đều có thể phát sáng dƣới tia UV. Ngƣợc lại ở Hình 4.1.b sản phẩm RNA tƣơng đối sạch, có thể là DNase I đã phân giải phần lớn các phân tử DNA nên khi nhuộm với ethium bromide thì không còn đủ số lƣợng để phát sáng dƣới tia UV.
Khi so sánh kết quả Hình 4.1.a và Hình 4.1.b thì ta có thể khẳng định: Tạp trong quá trình ly trích RNA (không sử dụng DNase I) phần lớn là DNA tế bào thực vật. Vì khi sử dụng DNase I thì kết quả điện di không thấy xuất hiện tạp.
Kết quả ly trích RNA đã không đạt kết quả hoặc do lƣợng RNA quá ít nên không đủ để phát sáng.
4.2.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA
1 2 3 4
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA
Chú thích:
Giếng 1: thực hiện phản ứng reverse transcription với 2 µl RNA tổng số Giếng 2: thực hiện phản ứng reverse transcription với 3 µl RNA tổng số Giếng 3: thực hiện phản ứng reverse transcription với 4 µl RNA tổng số Giếng 4: thực hiện phản ứng reverse transcription với 5 µl RNA tổng số
Kết quả điện di cho thấy khi chạy phản ứng reverse transcription với các thể tích RNA tổng số lần lƣợt 2 µl, 3 µl, 4 µl và 5 µl đều không cho sản phẩm cDNA trên gel điện di. Điều này có thể do lƣợng RNA tổng số ly trích đƣợc quá ít nên khi chạy reverse transcription sản phẩm cDNA tạo ra quá ít nên không phát sáng dƣới tia UV sau khi nhuộm ethium bromide, hoặc cũng có thể là quá trình reverse transcription đã không thành công.
4.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Chúng tôi đã tiến hành Blast trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và thu đƣợc kết quả là cả 2 cặp mồi L1, L2 và P28, M6 đều chỉ bắt cặp đặc hiệu với virus TSWV
dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds.
Length=8897
4.2.4. Kết quả phản ứng RT – PCR 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc
Sau khi thay đổi hầu hết các thông số phản ứng, kết quả chạy RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả dƣơng tính với virus TSWV, chúng tôi đƣa ra nhận định sau:
Kết quả ly trích RNA đã không thành công
Do quá trình tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành với mồi ngẫu nhiên hay mồi Oligo (dT) nên đôi khi không tạo ra sản phẩm là các đoạn gen cần khuếch đại.
Hàm lƣợng RNA tổng số quá thấp đến việc cDNA đƣợc tạo ra rất ít. Trong khi đó chúng ta chỉ sử dụng một lƣợng nhỏ sản phẩm cDNA để chạy PCR nên không cho kết quả dƣơng tính.
4.2.4.2. Phản ứng RT – PCR một bƣớc
Sau khi phản ứng RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả chúng tôi đã tiến hành chạy thử nghiêm quy trình RT – PCR một bƣớc với cặp mồi L1, L2và đã cho kết quả nhƣ sau:
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm RT – PCR một bƣớc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chú thích: L: Ladder
Từ kết quả trên ta thấy bên cạnh băng sản phẩm (276 bp) có xuất hiện băng sản phẩm phụ khoảng 140 bp. Điều này có thể do:
Nồng độ MgCl2 quá cao (2 mM) nên ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu của mồi. Nhiệt độ bắt cặp thấp (500C) so với Tm của mồi lần lƣợt là 53,70C và 56,50C làm giảm độ đặc hiệu của mồi.
Nồng độ Taq polymerase cao (2,5 U) cũng làm tăng mức độ tạp của sản phẩm RT – PCR.
Do điều kiện hạn chế của đề tài, ban đầu chúng tôi chỉ chuẩn bị hóa chất để chạy RT – PCR hai bƣớc nên chúng tôi chƣa có đủ điều kiện để tối ƣu, phản ứng RT – PCR một bƣớc chỉ dừng lại mức thử nghiệm.
Nhận định chung
Sau khi kết hợp kết quả phản ứng ELISA, phản ứng RT – PCR một bƣớc và phản ứng RT – PCR hai bƣớc có thể kết luận có hai nguyên nhân làm phản ứng RT – PCR không ra kết quả:
Phản ứng tạo cDNA đã không tạo ra sản phẩm chứa đoạn gen mong muốn. Hàm lƣợng RNA tổng số quá ít nên khi sử dụng lƣợng nhỏ (2 – 5 µl) để tổng hợp cDNA, sau đó lại chỉ dùng 2 µl trong tổng số 20 µl sản phẩm cDNA để chạy PCR. Nhƣ vậy lƣợng cDNA hút đƣợc để tiến hành PCR là rất ít hoặc có thể không có.
276 bp
Phần tạp L
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Sau khi tiến hành chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công thuộc tỉnh Tiền Giang chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Tỉ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra Xã Hòa Định: 12,0 %
Xã Bình Ninh: 13,16 % Xã Bình Nhì: 14,29 % Xã Thạnh Nhật: 10,0 %
Tỉ lệ nhiễm theo triệu chứng trung bình trong tỉnh là 60,0 %
Chƣa xây dựng đƣợc quy trình RT – PCR hai bƣớc chẩn đoán TSWV. Bƣớc đầu tìm ra đƣợc quy trình RT – PCR một bƣớc chẩn đoán bệnh TSWV, tuy nhiên cần tối ƣu một vài thông số để đạt hiệu quả tốt hơn.
5.2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu mức độ gây hại theo giống, theo độ tuổi và theo các thời điểm khác nhau trong năm. Đặc biệt nghiên cứu khả năng lây nhiễm TSWV trên các đối tƣợng khác.
Kết hợp sử dụng cây chỉ thị chẩn đoán sớm bệnh TSWV trên đồng ruộng. Tiếp tục xây dựng quy trình RT – PCR hia bƣớc chẩn đoán TSWV.
Dù quy trình RT – PCR một bƣớc cho ra sản phẩm nhƣng kết quả vẫn còn tạp. Chúng tôi đề nghị thay đổi các thông số về nhiệt độ, thời gian, số chu kì, hóa chất (Taq polymerase, MgCl2,MgCl2, primer) lƣợng RNA khuôn mẫu…. để kết quả tốt hơn.
Đối với phản ứng RT – PCR hai bƣớc để khắc phục trƣờng hợp hàm lƣợng RNA tổng số quá ít nên xây dựng quy trình Nested – PCR.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Mai Thị Phƣơng Anh, Trần Văn Lài và Trần Khắc Thi, 1996. Rau và trồng rau (giáo trình cao học nông nghiệp). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 254 trang
2. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003. Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng (quyển 2: cây thực phẩm). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 596 trang
3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2005. Sinh học phân tử (Giới thiệu phương pháp và ứng dụng). Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 238 trang
4. Tạ Thu Cúc, 1999. Kỹ thuật trồng cà chua. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.Hồ Chí Minh, Việt Nam. 104 trang
5. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp – Ứng dụng). Tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 301 trang
6. Lâm Ngọc Hạnh, 2005. Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quá trình chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 114 trang
7. Nguyễn Thị Lan, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 219 trang 8. Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi, 2004. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng. Nhà (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 103 trang.
10. Nguyễn Đình Trƣờng, 2005. Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 85 trang
11. Khoa Nông Học, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 2006. Giáo trình cây rau. 175 trang
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
12. Craig H. Canaday, 2007. Tomato spotted wilt virus (TSWV) information and control strategies. Dept of Entomology and Plant Pathology, The University of Tennessee, West Tennessee Research and Education Center (WTREC) Jackson, Tennessee. 8 pages
13. Sonya Broughton, Roger Jones and Brenda Coutts, 2004. Management of thrips and tomato spotted wilt virus. Farmnote No. 69/2004. 4 pages
14. M.J. McPherson and S.G. Moller, 2000. PCR. BIOS Scientific Publishers Ltd. Chapter 3/p 23 – 59
15. Paul Maris, 2004. Evaluation of thrips resistance in pepper to control Tomato spotted wilt virus infection. Thesis Wageningen University – with references – with summary in Dutch. ISBN 90 – 8504 – 002 – 7. 120 pages
16. J.Morris, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, Y041 1LZ, UK.
Protocol for the diagnosis of quarantine organisms. 35 pages
17. H. D. Shew and G. B. Lucas, 1990. Compendium of Tobacco disease. APS PRESS. 67 pages
18. College of Agricultural & Environmental Sciences, 2005. Tospoviruses In Solanaceae and Other Crops in The Coastal Plain of Georgia. Research report number 704, december, 2005.40 pages
19. Introduction to Antibodies – Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA). <http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp#General>
20. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay).
<http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=3097> INTERNET 21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 22. http://www.promega.com. 23. http://agdia.com/cgi_bin/catalog.cgi/39300. 24. http://www.apsnet.org/journals 25. http://docsach.dec.vn/noidung/55359.dec
PHỤ LỤC
Phụ lục 1
Phụ lục 2
Kết quả blast với cặp mồi L1, L2
Distance tree of results
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident Links AB190813.1
Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete
sequence
37.4 37.4 34% 3.3 100%
AY070218.1
Tomato spotted wilt virus RNA- dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds 37.4 37.4 34% 3.3 100% D10066.1
Tomato spotted wilt virus L RNA
encoding RNA polymerase, complete cds
37.4 74.7 68% 3.3 100% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dbj|AB190813.1| Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete
sequence Length=8917
Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 ||||||||||||||||||||
gb|AY070218.1| Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene,
complete cds Length=8640
Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3