Để xác định nồng độ tối ưu của kháng thể thỏ kháng ovalbumin tham gia vào phản ứng, 4 độ pha khác nhau của kháng thể thỏ kháng ovalbumin tinh chế ( kháng thể là hỗn hợp của 3 phân đoạn 3, 4, 5) được sử dụng là: 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/4000. Kháng nguyên ở cột đầu tiên cĩ nồng độ là 20 µg/ml sau đĩ được pha lỗng bậc hai từ cột 2 đến cột 11. Kết quả thể hiện ởđồ thị 3.5.
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phù hợp giữa các nồng độ kháng thể thỏ kháng ovalbumin trong phản ứng ELISA định lượng ovalbumin.
Kết quả từ hình 3.5 cho thấy, ởđộ pha kháng thể cao 1/500 cĩ mật độ quang cao nhất là 1,230±0,054, ở các độ pha 1/2000 và 1/4000 cũng cho mật độ quang cao nhất lần lượt là 1,120±0,042 và 0,612±0,038. Trong phản ứng ELISA thì các mật độ
quang này đều thấp, điều này khơng phù hợp với điều kiện phản ứng do mật độ
quang quá thấp.
Riêng ởđộ pha 1/1000 là nồng độ thích hợp nhất cho hệ ELISA vì cĩ mật độ
quang cao nhất là 1,557±0,060, đây là mật độ quang cao, đồng thời thể hiện sự
tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ kháng nguyên nên phù hợp với điều kiện của phản ứng. Kết quả thể hiện ở hình 3.5.
Ở độ pha kháng thể cao 1/500 mật độ quang thấp cĩ thể do nồng độ kháng thể gắn phiến quá nhiều dẫn đến sự cạnh tranh vị trí liên kết gắn phiến và gắn đặc hiệu với kháng nguyên ovalbumin. Do đĩ, những kháng thể khơng liên kết chặt chẽ
sẽ bị rửa trơi làm cho mật độ quang nền thấp.
Ở độ pha kháng thể 1/1000 là phù hợp do nồng độ kháng thể phù hợp với gắn phiến.
Cịn ở các độ pha 1/2000, 1/4000 cĩ mật độ quang thấp cĩ thể do nồng độ
kháng thể quá thấp dẫn đến số lượng kháng thể gắn phiến thấp, điều này làm cho mật độ quang thấp, khơng phù hợp với điều kiện của phản ứng.
Như vậy, nồng độ kháng thể quá cao hoặc quá thấp đều khơng phù hợp cho phản ứng ELISA định lượng ovalbumin. Ở độ pha kháng thể là 1/1000 là nồng độ
thích hợp nhất cho hệ ELISA này. Chính vì vậy, độ pha kháng thể 1/1000 sẽ được dùng cho các thử nghiệm tiếp theo.