a. Vật liệu và dụng cụ
Mẫu lá cao su bị bệnh rụng lá Corynespora và mẫu lá sạch bệnh lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 – VNNCSVN.
Máy đo quang phổ DR 5000, cối, chày, đá lạnh, micropipette các loại, eppendorf, cân điện tử, kéo, nước cất 2 lần, máy ly tâm lạnh, autoclave, tủ sấy, tủ lạnh.
b. Hoá chất:Phosphate buffer 0,1 M (pH = 7,0), dung dịch guaiacol 20 mM, dung dịch H2O2 4,2%.
3.2.4.3. Phƣơng pháp
Bố trí thí nghiệm
Từ 60 dvt sau khi gây bệnh nhân tạo, chia thành 4 cấp bệnh, từ mỗi cấp bệnh chọn ngẫu nhiên 3 dvt để xác định hoạt tính POD.
26
Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).
Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), trong mỗi nghiệm thức gồm 2 yếu tố: hoạt tính POD trên mẫu lá bệnh và mẫu lá không bệnh (đối chứng), mỗi yếu tố lặp lại 3 lần.
Tổng số mẫu: 72.
Điều kiện thí thiệm: ly trích enzyme ở điều kiện lạnh (khoảng 4ºC), bảo quản enzyme ở 0 – 4ºC, đo hoạt tính enzyme ở 25ºC.
Phương pháp ly trích peroxidase từ lá cao su.
Phương pháp đo hoạt tính peroxidase Phương pháp
Cho 3 ml dung dịch buffer + 0,05 ml dung dịch guaiacol + 0,1 ml dung dịch enzyme + 0,03 ml dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) vào trong cuvette. Trộn đều và đặt cuvette vào trong máy đo quang phổ kế. Đo ở bước sóng 436 nm.
Thêm 3ml phosphate buffer Cân 1 gam mẫu lá, cắt nhỏ, cho vào cối
Cho dịch nghiền vào eppendorf
Ly tâm 18.000 vòng/15 phút ở 5ºC.
Thu dịch nổi, cất giữ enzyme ở 0 – 4ºC. Nghiền trong điều kiện lạnh
27
Chỉ tiêu quan sát
Sau khi đặt cuvette vào máy đo quang phổ. Ghi nhận thời gian cần để sự hấp thu tăng thêm 0,05 ( t).
Họat tính enzyme được tính theo công thức sau: Trong đó:
3,18: thể tích cuối (ml).
0,1: lượng enzyme đem đo (ml). 1000: đổi đơn vị ml sang lít.
6.39: tương đương với 1 đơn vị enzyme tạo thành ở bước sóng 436 nm. 1: độ dài ánh sáng đi qua cuvette (cm2
).
Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0.