Lấy mẫu lá bệnh từ vườn đem về phòng thí nghiệm. Trước khi phân lập phải xác định hình thái sợi nấm và bào tử dưới kính hiển vi bằng cách dùng băng keo trong dán vào mặt dưới của lá bệnh sau đó ép lên lam kính.
Tại vị trí vết bệnh đặc trưng trên mẫu lá, cắt thành những miếng nhỏ tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh có kích thước 5 mm x 5 mm. Tiến hành rửa lá 1 lần với cồn 70ºC trong 30 giây. Sau đó rửa lại 2 lần với nước cất (cất 2 lần), khử trùng que kẹp trên ngọn đèn cồn, để nguội, dùng que kẹp gắp các mẫu lá đặt vào 5 vị trí trên đĩa môi trường (mặt dưới của lá tiếp xúc với bề mặt môi trường). Sau 2 ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C. cassicola được cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường PDA và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày ở điều kiện nhiệt độ 26 – 30ºC/2 – 3 ngày. Khi nấm phát triển, tiếp tục cấy chuyền sang môi truờng mới cho đến khi tạo được nguồn nấm thuần chủng.
3.2.2.3. Nhân số lƣợng bào tử
Từ nguồn nấm thuần chủng, lấy mẫu nấm với đường kính 0,8 cm cấy vào đĩa petri chứa môi trường PSA. Nấm C. cassiicola khó tạo bào tử trong môi trường nhân tạo, để có được một số lượng lớn bào tử trên môi trường nhân tạo ta có thể tiến hành như sau: đặt các đĩa petri này trong bóng tối 5 ngày liên tiếp để sợi nấm phát triển. Tiếp theo, dùng lam kính cạo nhẹ trên bề mặt của khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang liên tục trong 3 ngày.
23
3.2.3. Phƣơng pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu lá nguyên bằng cách lây bệnh nhân tạo
Thực hiện theo phương pháp của Chee (1988) và phương pháp này hiện đang được sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN.
3.2.3.1. Vật liệu và dụng cụ
Nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng (60 đĩa petri), micropipette, nước cất 2 lần, thuốc chống mốc (2 g/lít nước), giấy thấm nước, lưới sắt (24 cm x 14 cm), ống hút nhựa (có đường kính 1 cm), hộp plastic trong suốt có nắp đậy với kích thước: dài 25 cm, rộng 15 cm, cao 8 cm.
Mẫu lá sạch bệnh (60 dvt) lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 – VNCCSVN.
3.2.3.2. Phƣơng pháp
a. Bố trí thí nghiệm
Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD).
Số nghiệm thức: 60 (60 dvt), số lần lặp lại: 3, mỗi lần lặp lại 2 lá. Tổng số mẫu: 180, mỗi mẫu (1 hộp plastic).
Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 2 đợt. b. Phương pháp tiến hành
Đặt lớp giấy thấm nước xuống đáy hộp, cho nước cất (cất 2 lần) vào hộp đến khi vừa thấm ướt giấy là đủ, tiếp theo đă ̣t mô ̣t lớp ống hút nhựa lên trên lớp giấy, sau đó đặt tấm lưới sắt lên (lớp ống hút có tác dụng là làm cho lá không tiếp xúc trực tiếp với nước, tấm lưới sắt giúp cho lá giữ được thăng bằng để có thể nhỏ giọt dung dịch bào tử ở trên mặt lá).
Mẫu lá được rửa với thuốc chống mốc 1 lần trong 30 giây, sau đó rửa lại 3 lần với nước cất, thấm khô, đặt vào hộp đã được chuẩn bị sẵn ở trên (mặt trên của lá tiếp xúc với tấm lưới sắt). Dùng micropipette hút dịch bào tử đã qua lưới lọc, nhỏ lên hai bên gân chính của lá, mỗi bên 4 giọt (1 giọt = 20 µl).
Sau khi lây nhiễm, đặt các hộp plastic dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày. Nhiệt độ phòng 26 ± 2ºC.
24
c. Các chỉ tiêu, chu kỳ theo dõi và cách phân cấp mức độ bệnh. Chỉ tiêu theo dõi
Ghi nhận cấp bệnh (gồm 4 cấp từ 0 – 3) trên mỗi mẫu lá dựa vào số lượng và diện tích vết bệnh như Hình 3.1.
Hình 3.1: Minh họa phân cấp bệnh trên mẫu lá nguyên
(Nguồn: Bộ môn BVTV – VNCCSVN).
Theo dõi 3 lần vào các thời điểm 5, 7 và 10 ngày sau khi lây nhiễm. Cấp bệnh dựa theo bảng phân cấp bệnh đang sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Bảng phân cấp bệnh gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên
Cấp bệnh Triệu chứng Cấp 0 Cấp 1 Cấp 2 Cấp 3 Không bệnh
Lá có màu hơi ngăm đen ngay bên dưới giọt dung dịch bào tử Vết bệnh lan rộng và rõ nhưng chưa có sợi nấm
Vết bệnh lan rộng và rõ, xuất hiện nhiều sợi nấm
(Nguồn: Bộ môn BVTV – VNCCSVN). Phân hạng thống kê mức độ bệnh sau 10 ngày lây nhiễm theo cách tính sau:
25 Nặng: ≤ X < + Trung bình: – ≤ X < Nhẹ: X ≤ – Trong đó: X: cấp bệnh của mỗi dvt. : cấp bệnh trung bình của 60 dvt. : độ lệch chuẩn quần thể. d. Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel.
3.2.3.3. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: từ 15/03 – 30/05/2007.
Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn BVTV – VNCCSVN.
3.2.4. Phƣơng pháp đo hoạt tính peroxidase (POD) từ lá của một số dvt cao su
Thực hiê ̣n theo phương pháp của Thankamony và Philip (2006).
3.2.4.1. Mục đích
Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao.
3.2.4.2. Vật liệu, dụng cụ và hoá chất
a. Vật liệu và dụng cụ
Mẫu lá cao su bị bệnh rụng lá Corynespora và mẫu lá sạch bệnh lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 – VNNCSVN.
Máy đo quang phổ DR 5000, cối, chày, đá lạnh, micropipette các loại, eppendorf, cân điện tử, kéo, nước cất 2 lần, máy ly tâm lạnh, autoclave, tủ sấy, tủ lạnh.
b. Hoá chất:Phosphate buffer 0,1 M (pH = 7,0), dung dịch guaiacol 20 mM, dung dịch H2O2 4,2%.
3.2.4.3. Phƣơng pháp
Bố trí thí nghiệm
Từ 60 dvt sau khi gây bệnh nhân tạo, chia thành 4 cấp bệnh, từ mỗi cấp bệnh chọn ngẫu nhiên 3 dvt để xác định hoạt tính POD.
26
Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).
Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), trong mỗi nghiệm thức gồm 2 yếu tố: hoạt tính POD trên mẫu lá bệnh và mẫu lá không bệnh (đối chứng), mỗi yếu tố lặp lại 3 lần.
Tổng số mẫu: 72.
Điều kiện thí thiệm: ly trích enzyme ở điều kiện lạnh (khoảng 4ºC), bảo quản enzyme ở 0 – 4ºC, đo hoạt tính enzyme ở 25ºC.
Phương pháp ly trích peroxidase từ lá cao su.
Phương pháp đo hoạt tính peroxidase Phương pháp
Cho 3 ml dung dịch buffer + 0,05 ml dung dịch guaiacol + 0,1 ml dung dịch enzyme + 0,03 ml dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) vào trong cuvette. Trộn đều và đặt cuvette vào trong máy đo quang phổ kế. Đo ở bước sóng 436 nm.
Thêm 3ml phosphate buffer Cân 1 gam mẫu lá, cắt nhỏ, cho vào cối
Cho dịch nghiền vào eppendorf
Ly tâm 18.000 vòng/15 phút ở 5ºC.
Thu dịch nổi, cất giữ enzyme ở 0 – 4ºC. Nghiền trong điều kiện lạnh
27
Chỉ tiêu quan sát
Sau khi đặt cuvette vào máy đo quang phổ. Ghi nhận thời gian cần để sự hấp thu tăng thêm 0,05 ( t).
Họat tính enzyme được tính theo công thức sau: Trong đó:
3,18: thể tích cuối (ml).
0,1: lượng enzyme đem đo (ml). 1000: đổi đơn vị ml sang lít.
6.39: tương đương với 1 đơn vị enzyme tạo thành ở bước sóng 436 nm. 1: độ dài ánh sáng đi qua cuvette (cm2
).
Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0.
3.2.4.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thời gian thực hiện: 01/06 – 10/07/2007.
Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm của Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN.
3.2.5. Phƣơng pháp đếm số lƣợng khí khổng trên lá của một số dvt cao su
Thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Kim Linh (2005).
3.2.5.1. Mục đích
Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su.
3.2.5.2. Hoá chất và dụng cụ
Hoá chất collodium, đũa thuỷ tinh, lame, lamelle, kính hiển vi quang học. Mẫu lá sạch bệnh của 12 dvt được chọn ra từ 4 cấp bệnh, mỗi cấp bệnh 3 dvt sau khi đánh giá khả năng kháng bệnh rụng lá Corynespora.
3.2.5.3. Phƣơng pháp
Bố trí thí nghiệm:
Từ 60 dvt cao su sau khi gây bệnh nhân tạo in vivo, phân về 4 cấp bệnh, mỗi Hoạt tính enzyme (đơn vị / lít)
28
cấp bệnh chọn ra 3 dvt để tiến hành đếm mật độ khí khổng. Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).
Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), đơn yếu tố (số lượng khí khổng trên mẫu lá sạch bệnh), số lần lặp lại 3 (1 lần lặp lại là một vị trí đếm trên 1 lá/1 dvt). Tổng số mẫu: 36.
Phương pháp tiến hành
Thoa một lớp mỏng collodium (khoảng 1cm2) ở mặt dưới của lá cao su. Đợi cho collodium khô, bóc ra đem quan sát dưới kính hiển vi giữa hai lớp lam và lamelle. Đếm số khí khổng thấy được trong diện tích thị trường vật kính X40.
Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0.
3.2.5.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thời gian thực hiện: 10/07 – 30/07/2007.
29
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh rụng lá Corynesporatại Lai Khê
Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei., họ Moniliales gây ra, xuất hiện lần đầu tiên ở nước ta vào năm 1999 tại Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương.
Triệu chứng bệnh ban đầu khá đặc trưng như trên lá già là dạng xương cá dọc theo gân chính và gân phụ, lá chuyển dần sang màu đỏ cam, trên lá non là những vết tròn có tâm mỏng như giấy, bao quanh vết bệnh là vòng màu nâu hoặc đen có quầng vàng ở ngoài, đôi khi hình thành lỗ thủng tại tâm vết bệnh...
Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm và lượng mưa nhiều đó là điều kiện rất thuận lợi cho nấm gây CLFD phát triển cả về mức độ lẫn quy mô, đồng thời cũng có những biến đổi lớn về triệu chứng bệnh, kích thước vết bệnh và vị trí gây bệnh.
Mặt khác, cũng tùy theo tính mẫn cảm của từng dvt, tuổi lá, thời điểm nấm xâm nhiễm hoặc yếu tố môi trường đối với mầm bệnh mà chúng hình thành những triệu chứng không đặc trưng làm cho chúng ta khó xác định trực tiếp ngoài đồng ruộng mà phải đem về phòng thí nghiệm quan sát hình thái bào tử qua kính hiển vi.
Có một số triệu chứng không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora dễ gây nhầm lẫn với một số bệnh khác nhưng nếu quan sát kỹ vẫn có thể phân biệt được. Ví dụ, triệu chứng quăn đầu lá gần giống như bệnh héo đầu lá do nấm Colletotricum gloeosporioides (Penz) gây ra, điểm khác biệt lớn là bề mặt các đốm bệnh bằng phẳng, không có u lồi và có những viền màu nâu được bao quanh bởi quầng vàng.
Một số triệu chứng CLFD tại Vườn Dự án giống cao su Quốc gia – Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương (Hình 4.1a và Hình 4.1b).
30
Hình 4.1a: Một số triệu chứng bê ̣nh ru ̣ng lá Corynespora trên lá non
Hình 4.1b: Một số triệu chứng bê ̣nh ru ̣ng lá Corynespora trên lá già
Qua các đợt điều tra của Bộ môn BVTV tại các Vườn Sơ tuyển của VNCCSVN (Bảng 4.1) cho thấy hầu hết các vườn này đều bị nấm C. cassiicola tấn công và không một dvt nào có được tính kháng hoàn toàn với bệnh, 100% dvt trên Vết tròn có viền nâu được bao quanh bởi quầng vàng Cháy phiến lá Quăn đầu lá Dạng xương cá Dạng xương cá Lá biến dạng tạo lỗ trên vết bệnh
31
vườn đều nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Tuy nhiên, trên cuống và chồi rất ít gặp, bệnh gây trên lá là chủ yếu.
Bảng 4.1: Kết quả điều tra CLFD ở vƣờn sơ tuyển 03 và 04 tạiLai Khê
Tên vƣờn Ngày điều tra Số dvt Số dvt nhiễm bệnh
Vườn sơ tuyển 2003 Từ ngày 18/04/2006 đến 08/08/2006
72 72
Vườn sơ tuyển 2004 76 76
(Nguồn: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – VNCCSVN). Thực tế cho thấy, bệnh đã phát triển rất mạnh và hình thành nhiều triệu chứng khác nhau nếu không có biện pháp quản lý chặt chẽ thì bệnh sẽ có khả năng tích lũy và có cơ hội gây hại trên diện tích lớn cao su trong nước.
4.2. Kết quả phân lập
Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh (5 mm x 5 mm) trên môi trường PDA, từ mẫu bệnh sẽ xuất hiện sợi nấm mọc lan ra môi trường. Tiến hành tách một phần môi trường có sợi nấm sang đĩa môi trường khác, tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 3 – 4 ngày có thể xác định được sơ bộ nấm đó có phải là C. Cassiicola
hay không nhờ những đặc điểm đó là khuẩn lạc có màu xám, mặt dưới đĩa petri có màu đen (màu của độc tố được tiết ra môi trường).
Làm tiêu bản bào tử và quan sát dưới kính hiển vi quang học, so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971) để có thể khẳng định chắc chắn rằng mẫu nấm thu được là C. cassiicola.
Khi đã có nguồn nấm thuần chủng, tiến hành nhân số lượng bào tử
C. cassiicola để thực hiện thí nghiệm lây bệnh nhân tạo. Trên môi trường nhân tạo
nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử. Do vậy, để thu được số lượng lớn bào tử
C. cassiicola phục vụ cho việc lây bệnh nhân tạo cần tiến hành kích thích sợi nấm
sinh bào tử theo phương pháp của Chee (1988) và các tác giả khác được mô tả như sau: Đặt các đĩa petri này trong tối 5 ngày liên tiếp để sợi nấm phát triển, dùng lamelle cạo nhẹ trên bề mặt của khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử. Tiếp tục đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang liên tục trong 3 ngày.
32
tiến hành tách bào tử từ các đĩa nấm nguồn (cho vào mỗi đĩa 10 ml nước cất, cạo nhẹ trên bề mặt thạch để nấm tách ra khỏi môi trường nuôi cấy và hoà lẫn vào trong nước, thu dịch nấm trên đĩa thạch vào bình tam giác có lưới lọc).
Hình 4.2a:Khuẩn lạc C. cassiicola sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PSA
Hình 4.2b: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PSA
Kết quả: Phân lập được nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng. Số lượng bào tử trung bình: 8 bào tử/giọt (1 giọt = 20 µl).
Hình 4.3: Bào tử C. cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo PSA
4.3. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên
Đánh giá tính kháng CLFD bằng phương pháp in vivo hiện có hai cách đang được sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN là: lây bệnh nhân lá nguyên và lá tròn.
33
Tuy nhiên, qua nhiều đợt làm thí nghiệm của Bộ môn BVTV cho thấy mặc dù phương pháp gây bệnh trên mẫu lá tròn đem lại kết quả không sai lệch lớn so với kết quả gây bệnh trên mẫu lá nguyên. Nhưng khi so sánh kết quả của hai phương pháp trên với kết quả điều tra ngoài đồng ruộng cho thấy phương pháp thực hiện trên mẫu lá tròn cho kết quả không chính xác bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên. Do một số nguyên nhân sau:
Thứ nhất, lây bệnh trên mẫu lá tròn sử dụng mẫu lá không còn nguyên vẹn làm cho mẫu lá dễ bị úng nước.
Thứ hai, đối tượng của phương pháp gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá tròn là mẫu lá bánh tẻ nên độ mẫn cảm không cao bằng trên lá non (mẫu lá 10 ngày tuổi, đối với phương pháp gây bệnh trên mẫu lá nguyên). Vì vậy, tôi chỉ tiến hành phương pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên.
Sau 5, 7 và 10 ngày lây nhiễm nhân tạo bệnh rụng lá Corynespora, thu được kết quả về mức độ nhiễm bệnh (Phụ lục 1) và phân hạng mức độ nhiễm bệnh (Bảng 4.2) của 60 dvt cao su.
Bảng 4.2: Phân hạng mức độ nhiễm CLFD của 60 dvt cao su
Mức nhiễm bệnh Dòng vô tính* Nhẹ LH 94/481, LH 94/342, LH 94/592, LH 97/542, PB 235, PB 260, LH 94/286, LH 97/697, LH 94/337, LH 94/501, LH 97/563 Trung bình LH 91/999, LH 94/62, LH 98/1366, LH 94/475, LH 95/395, LH 97/267, LH 91/1119, LH 94/626, LH 95/115, LH 96/305,