Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh (5 mm x 5 mm) trên môi trường PDA, từ mẫu bệnh sẽ xuất hiện sợi nấm mọc lan ra môi trường. Tiến hành tách một phần môi trường có sợi nấm sang đĩa môi trường khác, tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 3 – 4 ngày có thể xác định được sơ bộ nấm đó có phải là C. Cassiicola
hay không nhờ những đặc điểm đó là khuẩn lạc có màu xám, mặt dưới đĩa petri có màu đen (màu của độc tố được tiết ra môi trường).
Làm tiêu bản bào tử và quan sát dưới kính hiển vi quang học, so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971) để có thể khẳng định chắc chắn rằng mẫu nấm thu được là C. cassiicola.
Khi đã có nguồn nấm thuần chủng, tiến hành nhân số lượng bào tử
C. cassiicola để thực hiện thí nghiệm lây bệnh nhân tạo. Trên môi trường nhân tạo
nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử. Do vậy, để thu được số lượng lớn bào tử
C. cassiicola phục vụ cho việc lây bệnh nhân tạo cần tiến hành kích thích sợi nấm
sinh bào tử theo phương pháp của Chee (1988) và các tác giả khác được mô tả như sau: Đặt các đĩa petri này trong tối 5 ngày liên tiếp để sợi nấm phát triển, dùng lamelle cạo nhẹ trên bề mặt của khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử. Tiếp tục đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang liên tục trong 3 ngày.
32
tiến hành tách bào tử từ các đĩa nấm nguồn (cho vào mỗi đĩa 10 ml nước cất, cạo nhẹ trên bề mặt thạch để nấm tách ra khỏi môi trường nuôi cấy và hoà lẫn vào trong nước, thu dịch nấm trên đĩa thạch vào bình tam giác có lưới lọc).
Hình 4.2a:Khuẩn lạc C. cassiicola sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PSA
Hình 4.2b: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PSA
Kết quả: Phân lập được nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng. Số lượng bào tử trung bình: 8 bào tử/giọt (1 giọt = 20 µl).
Hình 4.3: Bào tử C. cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo PSA