Bản chất của cơ chế tác động bởi enzyme trong phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn. Cơ chất tương tác với nhau do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự biến dạng các liên kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham gia vào các phản ứng hơn.
Điểm đặc biệt là khi có enzyme tham gia xúc tác thì năng lượng cần cho phản ứng nhỏ hơn khi không có enzyme và cũng nhỏ hơn so với các phản ứng được xúc tác bởi các chất xúc tác khác.
Quá trình xúc tác xảy ra qua 3 giai đoạn: E + S → ES → P +E Trong đó:
+ E: enzyme. + S: cơ chất. + P: sản phẩm.
Ở giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu. Kết quả là tạo thành một phức hợp ES, phức hợp này không bền. Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng.
Ở giai đoạn thứ hai: cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị.
Ở giai đoạn thứ 3: sản phẩm tạo thành, enzyme được giải phóng và trở lại trạng thái tự do (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
2.4.4. Các nhân tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme
Enzyme rất nhạy cảm với nhiều nhân tố: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, chất kìm hãm, các anion.
2.4.5. Một số phƣơng pháp xác định hoạt tính của enzyme
Theo Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa (2006), để phân tích hoạt độ enzyme có thể tiến hành bằng một trong hai cách là phân tích liên tục và phân tích gián đoạn. Tuy nhiên, dù phân tích theo cách nào thì cũng phải dựa trên nguyên tắc
15
chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme đó là phân tích sự biến đổi theo thời gian trong những điều kiện phản ứng xác định của cơ chất còn lại, hoặc sản phẩm tạo thành, hoặc cả cơ chất và sản phẩm.
Phân tích liên tục
Là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian.
Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng của cơ chất ở bước sóng , người ta có thể tiến hành phản ứng trong một cuvette và đo sự biến đổi của cơ chất bằng quang phổ kế theo thời gian ngay từ khi bổ sung enzyme vào dung dịch phản ứng có chứa sẵn cơ chất, hay bổ sung cơ chất vào hỗn hợp đã chứa sẵn enzyme.
Phương pháp đo liên tục thường hay áp dụng khi không có chất, hay cách làm ngừng phản ứng thích hợp hoặc được áp dụng đối với một số enzyme dễ bị mất hoạt tính xúc tác ở điều kiện phân tích. Ngoài ra, các phương pháp phân tích liên tục còn được dùng phổ biến với các nghiên cứu động học enzyme. Tuy nhiên, yêu cầu đối với thiết bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt để phản ứng có thể được thực hiện ở các nhiệt độ mong muốn. Đây cũng là một hạn chế của phương pháp. Ngoài ra, phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó có thể thực hiện phân tích hoạt độ của nhiều mẫu enzyme trong cùng một lúc.
Phân tích gián đoạn
Là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian nhất định thì làm ngừng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Đây là cách được sử dụng phổ biến nhấttrong các phân tích hoạt độ enzyme hiện nay.
Để làm ngừng phản ứng enzyme có thể dùng các tác nhân làm bất hoạt như nhiệt độ cao, thay đổi pH (bổ sung acid hoặc kiềm), dùng chất tạo phức hay tách enzyme ra khỏi hỗn hợp phản ứng… Phương pháp này khắc phục được những hạn chế của phương pháp đo liên tục, phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể ổn nhiệt, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu… Tuy vậy, vấn đề là phải tìm ra cách làm ngừng phản ứng thích hợp.
16
Dựa trên nguyên tắc xác định hoạt độ enzyme bằng cách đo liên tục hay gián đoạn, hoạt độ enzyme có thể xác định theo một hay một số phương pháp chính sau đây:
Phương pháp đo độ nhớt. Phương pháp phân cực kế. Phương pháp đo áp suất hay áp kế. Phương pháp quang phổ kế. Phương pháp chuẩn độ. Phương pháp sắc ký. Phương pháp hoá học. Phương pháp phóng xạ. Phương pháp huỳnh quang. Tuỳ theo các đặc trưng của phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp phân tích, yêu cầu về độ chính xác của phép đo cũng như điều kiện của phòng thí nghiệm mà có thể lựa chọn cách xác định nào là thích hợp nhất. Tuy vậy cách đáng tin cậy nhất trong mọi trường hợp là xác định sản phẩm tạo thành theo thời gian, bởi vì có các trường hợp, hoạt độ enzyme cần xác định có thể rất thấp, sự chuyển hoá cơ chất vốn phải có ở mức bão hoà có thể xảy ra nhưng rất khó đo được một cách chính xác. Khi đó, sự xuất hiện của sản phẩm phản ứng được xác định bằng những cách đo đặc hiệu, cho phép khẳng định sự có mặt của enzyme một cách đáng tin cậy.
2.4.6. Sơ lƣợc về enzyme liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật
Để hạn chế sự phát triển của các mầm bệnh do nấm gây ra thì các loại thực vật cũng tạo ra nhiều cơ chế để chống lại các mầm bệnh đó. Ký chủ có thể gia tăng thành tế bào của chúng bằng cách hình thành thêm thành tế bào, lignin… và tạo ra các hợp chất kháng vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp như phenol, quinone, alkaloid. Tăng cường tạo các enzyme và hoạt tính của chúng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng của thực vật. Các enzyme này thường xuất hiện dưới các dạng đồng hình khác nhau và thường liên quan đến quá trình tổng hợp các chất phòng vệ hoặc có tác động trực tiếp đến sự kháng khuẩn. Nhiều loại PR proteins (Pathogenesis Related Proteins) được xem như là enzyme. Khi không có sự xuất hiện của các chất từ sự nhiễm bệnh thì sự hoạt động của các enzyme này sẽ bị ức chế. PR proteins có thể chỉ xuất hiện sau khi đã phát sinh bệnh thì chúng mới có biểu hiện kháng. Một số PR proteins điển hình là -1,3-glucanase, chitinase, peroxidase, polyphenol oxidase… (Joseph, 2006).
17
2.4.7. Một số nghiên cứu về enzyme phòng vệ của cây cao su
Breton và ctv (1996), hoạt tính -1,3-glucanase khác nhau giữa các dòng vô tính khác nhau: GT 1, PB 235 và PB 260. Đồng thời ông cũng nhận thấy hoạt tính peroxidase cao hơn trong dòng kháng GT 1 và hoạt tính của chitinase của dvt GT 1 cũng tăng lên trong khi lây nhiễm nhân tạo bệnh Corynespora.
Hoạt tính của enzyme -1,3-glucanase của dvt GT 1 cũng được ghi nhận là tăng lên sau 24 tới 96 giờ lây bệnh Corynespora nhân tạo (Philip và ctv, 2001).
Năm 2006, Kurma và Jacob đã nghiên cứu sự thay đổi của các enzyme oxy hoá liên quan đến khả năng phòng vệ trên cả dvt cao su cảm nhiễm (RRII 105 và PB 260) và kháng (RRIM 600 và GT 1) khi chủng bệnh Corynespora và thấy rằng hoạt tính của enzyme oxy hoá liên quan đến khả năng phòng vệ ở các dòng kháng cao hơn ở các dòng cảm nhiễm.
2.4.8. Peroxidase
2.4.8.1. Sơ lƣợc về peroxidase
Dunford và Stillman (1976); Gray và Montgomery (1997) đã cho rằng peroxidase (POD) là enzyme oxy hoá khử phân bố rộng khắp mà sử dụng hydrogen POD hoặc các hydroperoxide hữu cơ như là các chất oxy hoá. Phần lớn POD là các glycoprotein chứa liên kết N – oligosaccharide (Miranda và ctv dẫn nhập, 2003).
Theo Chatchamon Daengkanit và Wallie Suvachittanont (2005), peroxidase là một hemeprotein xúc tác oxy hoá electron của các cơ chất khác nhau (phenol, các amine thơm) bởi H2O2. Heme peroxidase tồn tại ở nhiều nơi trong tự nhiên với nhiều chức năng sinh lý học và đã được phân thành 3 lớp dựa vào trình tự amino acid của chúng. Lớp I bao gồm các peroxidase nội bào, đó là cytochrome c
peroxidase, ascorbate peroxidase. Lớp II chứa các enzymes kích thích sự bài tiết của nấm, như là manganese peroxidase và lignin peroxidase. Lớp thứ III bao gồm các peroxidase kích thích bài tiết của thực vật.
Johann Putter (1974), thuật ngữ peroxidase (POD) trong nó mang một ý nghĩa rộng lớn bao gồm một nhóm enzyme chuyên biệt như NAD – POD, NADP – POD, acid béo – POD, cytochrome – POD và glutathione – POD cũng
18
như một nhóm enzyme không chuyên biệt từ các nguồn khác nhau, mà chúng được biết đến nhiều nhất là POD. POD xúc tác phản ứng khử hydro của một số lượng lớn các hợp chất hữu cơ như phenol và các amine thơm, các hydroquinone, các amine dehydroquinone, các dẫn xuất của benzidine. Đặc biệt là o-toluidine, guaiacol...
2.4.8.2. Vai trò của peroxidase đối với cây cao su
Theo Geiger và ctv (1989), hoạt tính peroxidase tăng lên khi cây chịu nhiều loại stress khác nhau. Ví dụ như bị tổn thương, sốc nhiệt hoặc sốc thẩm thấu và ô nhiễm không khí. Phản ứng này đã được nghiên cứu trong trường hợp nhiễm bệnh nơi mà thường xuyên liên quan đến kích thích hoạt tính POD để kháng lại mầm bệnh.Trong trường hợp này, peroxidase được xem là nhân tố điều khiển bước cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp lignin bằng cách tạo chất đồng trùng hợp cinnamyl alcohol dẫn đến sự gỗ hoá của mô tăng cao bất thường.Phản ứng lignin hoá này có thể hạn chế sự xâm nhiễm của mầm bệnh và sự phát triển mầm bệnh trong mô.
POD liên quan đến sự hóa gỗ của thành tế bào và trong quá trình biến dưỡng của sự oxy hoá hormone thực vật indole-3-acetic acid (IAA). Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn cơ chế tấn công của mầm bệnh, giúp chống mặn và giảm stress. Trong cây cao su, POD được tìm thấy nhiều ở gần lớp võ cây, có thể ngăn chặn được các vết thương (Daengkanit và Suvachittanont, 2005).
Joseph và ctv (2006), POD là một enzyme quan trọng tìm thấy trong thực vật. Nó đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp lignin và nó được biết đến như là chất xúc tác cho quá trình oxy hoá của mono và diphenol, các amine thơm để tăng độc tố quinone khi có sự hiện diện của hydrogen. POD được xem là độc tố của vi sinh vật.
2.5. Sơ lƣợc về khí khổng 2.5.1. Cấu tạo
Tế bào bảo vệ có một nhân lớn và nhiều lục lạp bé. Nó là tế bào biểu bì duy nhất có lục lạp ở cây sống trên cạn.
Vách nối giữa tế bào bảo vệ với tế bào phụ mỏng và sự dẫn truyền giữa chúng không cần sự có mặt của sợi liên bào. Tế bào bảo vệ dính với tế bào phụ và treo lơ lửng trên xoang dưới lỗ khí.
19
Hình 2.1: Cấu tạo khí khổng
(Nguồn:http://home.earthlink.net/~dayvdanls/guardcell.gif và http://www.herbdatanz.com/stoma-r.gif).
Tế bào bảo vệ dạng elip có vách phía bụng hóa dày nằm sát lỗ, vách phía lưng mỏng nằm xa lỗ.
Toàn bộ bộ máy lỗ khí được phủ bằng một lớp cutin dày nên ngăn sự mất nước khỏi tế bào bảo vệ (Nguyễn Ngọc Trì, 2005).
2.5.2. Sự phân bố
Theo Phạm Thị Lộc (2002), khí khổng gặp ở lớp biểu bì của tất cả các cơ quan, trừ rễ. Tuy nhiên, theo Nguyễn Ngọc Trì (2005), khí khổng có ở tất cả thực vật bậc cao, hầu hết ở thực vật bậc thấp (rêu, dương xỉ) ngoại trừ các cây thủy sinh mọc trong nước. Ở khỏa tử và bí tử, khí khổng có hầu hết ở các bộ phận cơ quan trên không như lá, thân, hoa, quả mặc dù trong vài trường hợp khí khổng không hoạt động. Kích thước, số lượng và sự phân bố khí khổng tùy thuộc rất nhiều vào loài, vào vị trí lá, vị trí trên từng bản lá, bội thể và điều kiện sống. Thông thường trên mỗi mm2
lá có 20 – 400 khí khổng. Tuy nhiên đôi khi có đến 1.000 khí khổng/mm2 hoặc hơn nữa.
Lá của các loại thân thảo một lá mầm như họ hòa bản thường mang khí Vách mỏng Lỗ khí Tế bào bảo vệ Nhân Lục lạp Không bào Tế bào thịt lá Xoang dưới lỗ khí
Tế bào bảo vệ Tế bào phụ Lỗ khí Tế bào biểu bì
20
khổng bằng nhau ở cả hai mặt lá. Ở loài thân thảo hai lá mầm, số lượng khí khổng ở mặt dưới lá nhiều hơn mặt trên. Hầu hết cây thân gỗ hai lá mầm khí khổng chỉ có ở mặt dưới lá trong khi ở các lá nổi trên mặt nước ở những loài cây thủy sinh thì khí khổng chỉ có ở mặt trên của lá, lá chìm trong nước thường không có khí khổng. Trong phần lớn trường hợp, khí khổng phân bố rải rác ngẫu nhiên trên phiến lá. Tuy nhiên, ở cây một lá mầm với lá có hệ mạch dẫn chạy song song, khí khổng được sắp xếp thành hàng nằm giữa các mạch dẫn.
2.5.3. Vai trò của khí khổng đối với thực vật
Khí khổng là con đường chủ yếu xâm nhập CO2 trong quang hợp và là con đường chủ yếu trong thoát hơi nước.
2.5.4. Chu kỳ đóng mở ngày đêm của khí khổng
Nét đặc trưng quan trọng của khí khổng là nó mở khi phản ứng với ánh sáng và đóng lại trong tối. Cũng có khi lỗ khí đóng lại một phần hay hoàn toàn giữa ngày khi cây bị mất nước nghiêm trọng, lá bị héo. Ngoại trừ cây mọng nước như xương rồng thì lỗ khí mở suốt đêm và đóng lại suốt ngày (Nguyễn Ngọc Trì, 2005).
Cây cao su là loại thực vật bậc cao nên cơ chế đóng mở khí khổng của chúng cũng tương tự như các loại thực vật khác. Khí khổng mở ra khi phản ứng với ánh sáng và đóng lại trong tối, đây là một trong những điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh xâm nhập qua khí khổng khi chúng mở ra. Theo Phan Thành Dũng (2004), bào tử C. cassiicola phóng thích cao điểm vào lúc 8 – 11 giờ. Mặt khác, đây cũng là thời điểm khí khổng mở ra nên rất thuận lợi cho nấm C. cassiicola xâm nhập.
Hình 2.2: Cấu tạo mở và đóng của khí khổng
21
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành
3.1.1. Thời gian
Từ tháng 03/03/2007 đến 30/07/2007.
3.1.2. Địa điểm
Địa điểm lấy mẫu: Vườn Dự án giống cao su Quốc gia và Vườn Sơ tuyển 03 – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (VNCCSVN) tại Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương.
Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm của Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN.
3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu lá cao su của một số dvt bị nhiễm bệnh Corynespora và mẫu lá hoàn toàn sạch bệnh. Mẫu lá được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm là khoảng 10 – 12 ngày tuổi.
3.2. Phƣơng pháp tiến hành 3.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu lá
a. Đối với lá bệnh (10 – 12 ngày tuổi)
Mẫu lá phải được lấy trước 8 giờ sáng khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử còn nằm trên vết bệnh chưa phóng thích vào không khí.
Chọn những mẫu lá có vết bệnh đặc trưng. Sau đó giữ ẩm để đưa về phòng thí nghiệm.
b. Đối với mẫu lá sạch bệnh (10 – 12 ngày tuổi)
Mẫu lá phải được lấy trước 8 giờ sáng. Phải xem kỹ và chắc chắn rằng trên gân lá và phiến lá không có bất kỳ một vết bệnh nào dù lớn hay nhỏ. Ghi rõ tên dvt
22
lấy mẫu. Sau đó giữ ẩm để đưa về phòng thí nghiệm.
3.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm C. cassiicola
3.2.2.1. Hoá chất và dụng cụ
Dụng cụ: becher, bình tam giác, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pence, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, autoclave, tủ sấy, hộp plastic đựng mẫu, giấy thấm nước, bút lông, băng keo.
Hoá chất:
Môi trường PDA, PSA (cách pha chế Phụ lục 2). Thuốc nhuộm Methylene blue.
3.2.2.2. Phân lập mẫu nấm
Lấy mẫu lá bệnh từ vườn đem về phòng thí nghiệm. Trước khi phân lập phải xác định hình thái sợi nấm và bào tử dưới kính hiển vi bằng cách dùng băng keo trong dán vào mặt dưới của lá bệnh sau đó ép lên lam kính.
Tại vị trí vết bệnh đặc trưng trên mẫu lá, cắt thành những miếng nhỏ tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh có kích thước 5 mm x 5 mm. Tiến hành rửa lá 1