Cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể được pha ở nồng độ cao nhất có thể
500 mg/kg thể trọng chuột nhằm khảo sát độc tính của cao chiết. Chuột chia làm 2 lô (mỗi lô 6 con) lần lượt ứng với cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể.
* Cách tiến hành:
- Pha cao chiết với 10 % DMSO và nước cất thành các nồng độ nói trên.
- Cho chuột nhịn ăn 18 giờ rồi cho uống dung dịch cao EtOAc. Sau khi uống cho chuột ăn uống bình thường.
- Quan sát và theo dõi ghi nhận hành vi, biểu hiện và sự sống chết của chuột trong các lô sau 24 giờ.
3.2.3.3.Thí nghiệm 3: Sàng lọc cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể
* Nguyên tắc sàng lọc tác dụng ức chế xơ gan trên mô hình chuột nhiễm độc CCl4
invivo
- Tiến hành gây xơ gan thú thử nghiệm bằng CCl4 và chế độ ăn uống giàu lipid – ethanol trong 8 tuần. [11]
- Cho chuột xơ gan dùng thuốc thử nghiệm hàng ngày từ khi bắt đầu cho uống CCl4 cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Sau 3 ngày uống CCl4 cuối cùng lấy máu đuôi chuột ở các lô thử và lô độc đo enzym gan ALT, AST để theo dõi tác dụng hạ enzym gan của các mẫu thử. Mổ chuột lấy gan xét nghiệm mô học đểđánh giá sự hình thành xơ gan trên chuột của thuốc thử nghiệm.
* Mô hình thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên mô hình in vivo trên gan chuột bị gây xơ bằng CCl4. [11]
* Bố trí thí nghiệm
Chuột được chia làm 3 lô.
- Lô 1: Lô chứng trắng (kí hiệu Lo), chỉ cho uống nước và ăn thức ăn tổng hợp.
- Lô 2: Lô độc (kí hiệu Lđ), gây xơ
Dùng chuột nhắt trắng, con đực, nặng 20 – 30 g khỏe mạnh. Gây xơ gan bằng cách cho uống CCl4, mỗi tuần cho uống 2 lần với liều 1,2 ml/kg, liền trong 8
tuần. Song song với uống CCl4 cho chuột ăn bằng thức ăn tổng hợp, có thêm 20% mỡ động vật và 0,05% cholesterol; còn nước uống, cứ 1 ngày cho uống nước thường, lại 1 ngày cho uống nước có pha thêm 30% ethanol. Riêng những ngày uống CCl4, cho chuột uống nước thường. Chuột được cho ăn bình thường, liền trong 8 tuần, hết 8 tuần, chuột sẽ được lấy máu ởđuôi đểđo enzym gan và sau đó mổ chuột lấy gan xét nghiệm mô học.
- Lô 3: Lô thử (kí hiệu L), gây xơ gan và dùng cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể hàng ngày.
* Lấy máu ởđuôi chuột (Hình 3.4)
- Cầm chuột trên tay sao cho thân chuột được thẳng đuôi. Sau đó, dùng bông gòn tẩm cồn 90 % vuốt nhẹ hai bên đuôi, dùng kéo cắt xéo một đoạn nhỏ của đuôi chuột, rồi nhẹ nhàng vuốt đuôi để lấy máu.
- 0,1 ml máu chuột được hòa trong EDTA 0,1 % (1:5) để tránh đông máu. - Li tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết tương.
- Kết quảđược tính toán và xử lý theo mục 4.1.3.
* Mổ chuột lấy gan (Hình 3.5)
- Gây mê chuột bằng ether. - Cốđịnh chuột trên bàn mổ. - Mổổ bụng của chuột.
- Tách gan ra khỏi cơ thể chuột.
- Rửa gan trong dung dịch NaCl 0,9 %.
- Cho gan đã rửa vào formol 10 %. Sau đó đem mẫu gửi qua bộ môn giải phẫu học của trường ĐH Y Dược thành phố Hồ Chí Minh ở Hồng Bàng, Quận 5 để giải phẫu vi thể.
* Các thuốc thử dùng đểđo hoạt lực enzym gan
•Đo hoạt lực enzym gan ALT
ALT ( alanin aminotransferase ) là một enzym hiện diện trong bào tương của tế
bào. ALT xúc tác cho quá trình di chuyển của nhóm aminoacid trong suốt quá trình biến
đổi của aminoacid và alpha - ketoacid. Pirydoxal phosphat làm hoạt hóa quá trình. Enzym này tìm thấy trong huyết tương phần lớn là từ gan và thận. Nồng độ của enzym ALT trong huyết tương sẽ tăng lên khi có một số bệnh về gan.
ALT xúc tác cho sự biến đổi của L-alanin và 2 – oxoglutarate tại pH tối ưu. Pyruvat sinh ra trong quá trình này sẽ được biến đổi bởi lactat dehydrogenase ( LDH )
với sự hiện diện của coenzym NADH / NAD+ taọ ra L - lactat, trong khi quá trình oxi hóa khử NADH/NAD+ làm giảm độ hấp thu tại bước sóng 340 nm. Sự thay đổi của độ hấp thu sẽ tương đương với hoạt độ ALT trong huyết tương.
•Đo hoạt lực enzym gan AST
AST (aspartat transaminase) là một enzym hiện diện trong nhiều mô khác nhau, AST hoạt động nhiều trong các cơ quan như: cơ tim, xương, gan và thận. Sự tổn thương các mô sẽ cho kết quả đo AST cao có thể thấy ở những bệnh như: viêm gan do virus, chứng nhồi máu cơ tim, sự hoại tử tế bào gan. Kết quả kiểm tra AST và ALT trong huyết tương cao phản ánh nguyên nhân do có bệnh về gan. Mức độ AST thấp là sự biểu hiện thiếu vitamin B6.
AST là enzym xúc tác chuyển đổi nhóm amino trong sự chuyển hóa của amino acid và α – ketoacid. Hoạt lực của enzym AST tăng trong 4 – 8 giờ sau khi bị nhồi máu cơ tim, tăng cao nhất trong 2 – 3 ngày và giảm dần trong 5 – 6 ngày.
Hai chất nền tham gia trong phản ứng xúc tác của AST là L – aspartat và oxoglutarat. Với sự hỗ trợ của coenzym NADH, malat dehydrogenase (MDH) có trong thuốc thử sẽ xúc tác sự biến đổi này và oxalacetat được sinh ra trong phản ứng đầu tiên. Quá trình oxi hoá khử của NADH / NAD+ làm giảm độ hấp thu ở bước sóng 340 nm. lactat dehydrogenase (LHD) có tác dụng trong việc trung hoà sự rối loạn của pyruvat chứa trong mẫu thử.
ALT LDH
L – alanin + α – Ketoglutarat Pyruvat + L – Glutamat
Pyruvat + NADH L – Lactat + NAD
AST
L – Glutamat + Oxalacetat MDH
Oxalacetat + NADH L – Malat + NAD+
•Cách đo ALT, AST
Hòa trộn 100 µl huyết tương mẫu cần đo với 1 ml thuốc thử rồi ủ ở 37 0C trong 2 phút, đo độ hấp thu ở từng phút trong suốt 2 phút ở bước sóng 340 nm.
•Cách tính hoạt lực ALT (theo hướng dẫn sử dụng thuốc thử của hãng sản xuất) Hoạt lực U/L = Δ A/phút x 2200
•Cách tính hoạt lực AST (theo hướng dẫn sử dụng thuốc thử của hãng sản xuất) Hoạt độ U/L = Δ A/phút x 2000
Δ A = độ chênh lệch vềđộ hấp thu trong hai phút.
•Cách tính tỉ lệ hạ enzym gan các lô thử cao EtOAc so với lô độc
Tỉ lệ hạ enzym gan =
% enzym gan giảm
= Hoạt độ U/L của lô độc - Hoạt độ U/L của lô thử cao EtOAC
Hoạt độ U/L của lô độc X 100 % UI đ UI m UI đ: hoạt lực UI của mẫu độc UI m: hoạt lực UI của mẫu thử
a. Gây mê bằng ether
b. Cốđịnh trên bàn mổ
d. Rửa gan trong NaCl 0,9 %
c. Mổổ bụng
e. Ngâm gan trong Formol 10 %