3.2.3.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát sơ bộ nồng độ gây độc của CCl4
Chuột được chia làm 6 lô (mỗi lô 6 con), được cho uống CCl4 với các nồng độ
tương ứng: 100 %, 50 %, 30 %, 25 %, 20 %, 10 %. * Cách tiến hành:
- Pha CCl4 với dầu thực vật thành các nồng độ nói trên
- Cho chuột nhịn ăn 18 giờ rồi cho uống dung dịch CCl4. Sau khi uống cho chuột
ăn uống bình thường.
- Quan sát và theo dõi ghi nhận hành vi, biểu hiện và sự sống chết của chuột trong các lô sau khi gây độc và sau 24 giờ.
3.2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát độc tính của cao chiết
Cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể được pha ở nồng độ cao nhất có thể
500 mg/kg thể trọng chuột nhằm khảo sát độc tính của cao chiết. Chuột chia làm 2 lô (mỗi lô 6 con) lần lượt ứng với cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể.
* Cách tiến hành:
- Pha cao chiết với 10 % DMSO và nước cất thành các nồng độ nói trên.
- Cho chuột nhịn ăn 18 giờ rồi cho uống dung dịch cao EtOAc. Sau khi uống cho chuột ăn uống bình thường.
- Quan sát và theo dõi ghi nhận hành vi, biểu hiện và sự sống chết của chuột trong các lô sau 24 giờ.
3.2.3.3.Thí nghiệm 3: Sàng lọc cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể
* Nguyên tắc sàng lọc tác dụng ức chế xơ gan trên mô hình chuột nhiễm độc CCl4
invivo
- Tiến hành gây xơ gan thú thử nghiệm bằng CCl4 và chế độ ăn uống giàu lipid – ethanol trong 8 tuần. [11]
- Cho chuột xơ gan dùng thuốc thử nghiệm hàng ngày từ khi bắt đầu cho uống CCl4 cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Sau 3 ngày uống CCl4 cuối cùng lấy máu đuôi chuột ở các lô thử và lô độc đo enzym gan ALT, AST để theo dõi tác dụng hạ enzym gan của các mẫu thử. Mổ chuột lấy gan xét nghiệm mô học đểđánh giá sự hình thành xơ gan trên chuột của thuốc thử nghiệm.
* Mô hình thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên mô hình in vivo trên gan chuột bị gây xơ bằng CCl4. [11]
* Bố trí thí nghiệm
Chuột được chia làm 3 lô.
- Lô 1: Lô chứng trắng (kí hiệu Lo), chỉ cho uống nước và ăn thức ăn tổng hợp.
- Lô 2: Lô độc (kí hiệu Lđ), gây xơ
Dùng chuột nhắt trắng, con đực, nặng 20 – 30 g khỏe mạnh. Gây xơ gan bằng cách cho uống CCl4, mỗi tuần cho uống 2 lần với liều 1,2 ml/kg, liền trong 8
tuần. Song song với uống CCl4 cho chuột ăn bằng thức ăn tổng hợp, có thêm 20% mỡ động vật và 0,05% cholesterol; còn nước uống, cứ 1 ngày cho uống nước thường, lại 1 ngày cho uống nước có pha thêm 30% ethanol. Riêng những ngày uống CCl4, cho chuột uống nước thường. Chuột được cho ăn bình thường, liền trong 8 tuần, hết 8 tuần, chuột sẽ được lấy máu ởđuôi đểđo enzym gan và sau đó mổ chuột lấy gan xét nghiệm mô học.
- Lô 3: Lô thử (kí hiệu L), gây xơ gan và dùng cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể hàng ngày.
* Lấy máu ởđuôi chuột (Hình 3.4)
- Cầm chuột trên tay sao cho thân chuột được thẳng đuôi. Sau đó, dùng bông gòn tẩm cồn 90 % vuốt nhẹ hai bên đuôi, dùng kéo cắt xéo một đoạn nhỏ của đuôi chuột, rồi nhẹ nhàng vuốt đuôi để lấy máu.
- 0,1 ml máu chuột được hòa trong EDTA 0,1 % (1:5) để tránh đông máu. - Li tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết tương.
- Kết quảđược tính toán và xử lý theo mục 4.1.3.
* Mổ chuột lấy gan (Hình 3.5)
- Gây mê chuột bằng ether. - Cốđịnh chuột trên bàn mổ. - Mổổ bụng của chuột.
- Tách gan ra khỏi cơ thể chuột.
- Rửa gan trong dung dịch NaCl 0,9 %.
- Cho gan đã rửa vào formol 10 %. Sau đó đem mẫu gửi qua bộ môn giải phẫu học của trường ĐH Y Dược thành phố Hồ Chí Minh ở Hồng Bàng, Quận 5 để giải phẫu vi thể.
* Các thuốc thử dùng đểđo hoạt lực enzym gan
•Đo hoạt lực enzym gan ALT
ALT ( alanin aminotransferase ) là một enzym hiện diện trong bào tương của tế
bào. ALT xúc tác cho quá trình di chuyển của nhóm aminoacid trong suốt quá trình biến
đổi của aminoacid và alpha - ketoacid. Pirydoxal phosphat làm hoạt hóa quá trình. Enzym này tìm thấy trong huyết tương phần lớn là từ gan và thận. Nồng độ của enzym ALT trong huyết tương sẽ tăng lên khi có một số bệnh về gan.
ALT xúc tác cho sự biến đổi của L-alanin và 2 – oxoglutarate tại pH tối ưu. Pyruvat sinh ra trong quá trình này sẽ được biến đổi bởi lactat dehydrogenase ( LDH )
với sự hiện diện của coenzym NADH / NAD+ taọ ra L - lactat, trong khi quá trình oxi hóa khử NADH/NAD+ làm giảm độ hấp thu tại bước sóng 340 nm. Sự thay đổi của độ hấp thu sẽ tương đương với hoạt độ ALT trong huyết tương.
•Đo hoạt lực enzym gan AST
AST (aspartat transaminase) là một enzym hiện diện trong nhiều mô khác nhau, AST hoạt động nhiều trong các cơ quan như: cơ tim, xương, gan và thận. Sự tổn thương các mô sẽ cho kết quả đo AST cao có thể thấy ở những bệnh như: viêm gan do virus, chứng nhồi máu cơ tim, sự hoại tử tế bào gan. Kết quả kiểm tra AST và ALT trong huyết tương cao phản ánh nguyên nhân do có bệnh về gan. Mức độ AST thấp là sự biểu hiện thiếu vitamin B6.
AST là enzym xúc tác chuyển đổi nhóm amino trong sự chuyển hóa của amino acid và α – ketoacid. Hoạt lực của enzym AST tăng trong 4 – 8 giờ sau khi bị nhồi máu cơ tim, tăng cao nhất trong 2 – 3 ngày và giảm dần trong 5 – 6 ngày.
Hai chất nền tham gia trong phản ứng xúc tác của AST là L – aspartat và oxoglutarat. Với sự hỗ trợ của coenzym NADH, malat dehydrogenase (MDH) có trong thuốc thử sẽ xúc tác sự biến đổi này và oxalacetat được sinh ra trong phản ứng đầu tiên. Quá trình oxi hoá khử của NADH / NAD+ làm giảm độ hấp thu ở bước sóng 340 nm. lactat dehydrogenase (LHD) có tác dụng trong việc trung hoà sự rối loạn của pyruvat chứa trong mẫu thử.
ALT LDH
L – alanin + α – Ketoglutarat Pyruvat + L – Glutamat
Pyruvat + NADH L – Lactat + NAD
AST
L – Glutamat + Oxalacetat MDH
Oxalacetat + NADH L – Malat + NAD+
•Cách đo ALT, AST
Hòa trộn 100 µl huyết tương mẫu cần đo với 1 ml thuốc thử rồi ủ ở 37 0C trong 2 phút, đo độ hấp thu ở từng phút trong suốt 2 phút ở bước sóng 340 nm.
•Cách tính hoạt lực ALT (theo hướng dẫn sử dụng thuốc thử của hãng sản xuất) Hoạt lực U/L = Δ A/phút x 2200
•Cách tính hoạt lực AST (theo hướng dẫn sử dụng thuốc thử của hãng sản xuất) Hoạt độ U/L = Δ A/phút x 2000
Δ A = độ chênh lệch vềđộ hấp thu trong hai phút.
•Cách tính tỉ lệ hạ enzym gan các lô thử cao EtOAc so với lô độc
Tỉ lệ hạ enzym gan =
% enzym gan giảm
= Hoạt độ U/L của lô độc - Hoạt độ U/L của lô thử cao EtOAC
Hoạt độ U/L của lô độc X 100 % UI đ UI m UI đ: hoạt lực UI của mẫu độc UI m: hoạt lực UI của mẫu thử
a. Gây mê bằng ether
b. Cốđịnh trên bàn mổ
d. Rửa gan trong NaCl 0,9 %
c. Mổổ bụng
e. Ngâm gan trong Formol 10 %
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.Kết quảxử lý nguyên liệu
* Định danh
• Cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus)
Cây Râu mèo thuộc loại thân thảo, thân non vuông, nhẹ, xốp, dài 20 – 50 cm, mặt ngoài thân màu nâu tím có rãnh dọc, lông trắng nhỏ. Lá mọc đối, chéo chữ thập, cuống ngắn, mép có răng cưa, đầu lá thuôn nhọn, hai mặt lá màu lục sẫm. Cụm hoa nằm
ởđầu cành.
•Cây Nghể (Polygonum toenzymtosum Willd. )
Cây thân thảo, thân mọc thẳng, rỗng, cao 40 – 70 cm, mặt ngoài có rãnh dọc. Phiến lá dày có hình mũi mác, lá kèm ở gốc lá có ống bao lấy gốc gọi là bẹ chìa. Cụm hoa hình xim, họp thành cụm kép phức tạp.
Hình 4.1:Mẫu cây Râu mèo trồng ở các vườn
Hình 4.2:Mẫu cây Râu mèo trồng ở vườn dược liệu
* Xác định độẩm nguyên liệu
Tiến hành xác định độ ẩm nguyên liệu theo phụ lục 5.16 trong DĐVN III. Lấy kết quả trung bình qua 3 lần thực hiện.
Bảng 4.1: Xác định độ ẩm nguyên liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Râu mèo (%) 11,9 12,13 11,58 11,87 ± 0.08 Nghể (%) 13,37 14,95 15,34 14,55 ± 1.09
Kết quả xác định độẩm nguyên liệu đạt tiêu chuẩn DĐVN.
Xác định độẩm nguyên liệu để tính phần trăm lượng cao thu được thực tế.
* Xác định độẩm của cao chiết
Tiến hành xác định độ ẩm cao chiết theo phụ lục 5.16 trong DĐVN III. Lấy kết quả trung bình qua 3 lần thực hiện. Bảng 4.2: Xác định độ ẩm cao chiết Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trungbình Râu mèo (%) 0,02 0,02 0,03 0,023 ± 0.00033 Nghể (%) 0,03 0,02 0,02 0,023 ± 0.00033
Kết quả xác định độẩm của cao chiết đạt tiêu chuẩn cao khô.
4.2.Kết quả chiết xuất
Chiết xuất dược liệu được thực hiện bằng phương pháp đun hồi lưu theo sơ đồ 4.1 thu
Bảng 4.3: Xác định phần trăm cao chiết EtOAc thu được thực tế Cây Râu mèo Cây Nghể
Khối lượng cao EtOAc thu được (g) 1.5 2.8 Phần trăm cao EtOAc thu được (%) 17 3.2
200 ml cồn 96 %, hồi lưu / 60 phút – lọc
X 4 lần
Lắc với Ethyl acetat
Cô quay loại dung môi
Dung môi CHCl3
Trích ly lỏng – lỏng
Cô quay loại dung môi
MeOH - H2O (1:4)
Sơđồ 4.1: Quy trình chiết tách dược liệu điều chế cao EtOAc
Mẫu thử
Dịch MeOH - H2O Cao cồn toàn phần
Dịch CHCl3
Cao CHCl3
Dịch chiết MeOH – H2O sau lắc CHCl3
Dịch chiết MeOH – H2O sau lắc EtOAc
4.3.Kết quả thử sinh học
4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sơ bộ nồng độ gây độc CCl4
Chuột được chia làm 6 lô (mỗi lô 6 con), các lô chuột được cho uống CCl4ứng với các nồng độ CCl4 (pha với dầu thực vật) như sau: 100 %, 50 %, 30 %, 25 %, 20 % và 10 %.
Bảng 4.4: Kết quả tỉ lệ chuột sống sau 24 giờ uống CCl4
Lô Tỉ lệ sống (%) 100 % 0 50 % 33 30 % 67 25 % 100 20 % 100 10 % 100
Kết quả cho thấy ở các nồng độ CCl4 100 %, 50 %, 30 % không đạt yêu cầu về tỉ lệ
sống, còn ở 20 % và 10 % thì tỉ lệ sống tốt nhưng độc tính không thể hiện rõ. Riêng lô 25 % thì vừa đạt yêu cầu về tỉ lệ sống vừa thể hiện độc tính rõ như: mắt lừđừ, thở dốc, mệt lả, nằm im, chân co quắp.
Vì vậy, tất cả các thử nghiệm in vivo tiếp theo đều sử dụng lô chứng độc có nồng
độ CCl4 là 25%.
4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát độc tính của cao chiết
Cao EtOAc của 2 cây được pha ở nồng độ cao nhất có thể pha loãng 500 mg/kg thể
trọng chuột để khảo sát độc tính cao chiết. Gồm 2 lô ứng với cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể
Bảng 4.5: Kết quả các lô sau 24 giờ.
Lô cao EtOAc Tỉ lệ chuột sống (%)
Râu mèo 100
Nghể 100
Quan sát hành vi của chuột sau khi uống thuốc: hơi mệt nhưng vẫn linh hoạt Sau 24 giờ uống thuốc: chuột khoẻ mạnh, nhanh nhẹn, linh hoạt.
Vậy các kết quả cho thấy cao EtOAc của 2 cây hoàn toàn không gây độc cho chuột ở liều 500 mg/kg thể trọng chuột
4.3.3. Thí nghiệm 3: Sàng lọc in vivo cao EtOAc của cây Râu mèo và Nghể
* Thiết kế thí nghiệm
Cho chuột nhịn ăn 18 giờ trước khi uống CCl4.
Các lô được cho uống với liều 0,1 ml/10 g chuột, trong suốt 8 tuần.
- Lo: Chuột được uống dung dịch DMSO 10 %, 2 lần / tuần vào ngày thứ 3, thứ 6. - Lđ: Chuột được uống CCl4 25 % pha trong 0,05 % cholesterol + 20 % mỡ + 10 % DMSO + dầu thực vật, 2 lần / tuần vào ngày thứ 3, thứ 6. Xen kẽ với uống cồn 30 % trong những ngày không uống CCl4.
- L1: Lô thử cao chiết EtOAc Râu mèo. Chuột được cho uống CCl4, cồn tương tự
lô độc. Song song đó chuột sẽ được cho uống 1 mg/ml cao chiết EtOAc cây Râu mèo pha trong 10 % DMSO và nước, được cho uống hàng ngày.
- L2: Lô thử cao chiết EtOAc Nghể. Chuột được cho uống CCl4, cồn tương tự lô
độc. Song song đó chuột sẽđược cho uống 1 mg/ml cao chiết EtOAC cây Nghể pha trong 10 % DMSO và nước, được cho uống hàng ngày.
Bảng 4.6: Bảng thực hiện công việc cho chuột uống CCl4 và cao chiết ở các lô; uống (x), không uống (-). Chất thử nghiệm Lô trắng Lô độc Lô thử Chứng trắng DMSO 10 % x - - Tác nhân gây độc CCl4 25 % + 0,05 % cholesterol + 20 % mỡ + 10 % DMSO + dầu thực vật - x x Cồn 30 % - x x
Thuốc thử Cao chiết - - x
* Đánh giá kết quả
3 ngày sau khi chuột uống liều CCl4 cuối cùng, lấy máu ở đuôi chuột, ly tâm lấy huyết tương để tiến hành đo enzym gan ALT, AST. Sau đó mổ chuột lấy gan để xét nghiệm mô học.
•Nhận xét biểu hiện của chuột trong các lô thử nghiệm
Tiến hành thử nghiệm sinh học theo mục 3.2.3 trong 8 tuần. Quan sát chuột ở các lô thử nghiệm, ta thấy biểu hiện của chuột như sau:
- Lô chứng trắng (Lo), chuột được uống dung dịch DMSO 10 % có các biểu hiện
ăn uống bình thường (Hình 4.4). Trọng lượng cơ thể tăng đồng đều và không có con nào chết trong suốt 8 tuần.
- Lô độc (Lđ), chuột được cho uống CCl4 khoảng 15 phút sau có biểu hiện mắt lừ đừ, mệt lả, thở dốc, có những con chạy nhảy loạn xạ, khoảng sau 30 phút thấy lông chuột xù, bám lại với nhau, đổ mồ hôi ở dưới hầu của chuột (Hình 4.5). Một giờ sau chuột trở
những ngày thay nước bằng cồn 30 % chuột uống ít. Trọng lượng cơ thể chuột trong tuần
đầu bị giảm, sau đó tăng trở lại và suốt 8 tuần trọng lượng cơ thể chuột tăng ít, trung bình khoảng 6 – 7 g/con, có một vài con gần như không tăng cân so với lúc đầu.
- Lô thử cao EtOAc Râu mèo (L1), chuột sau khi được cho uống CCl4 cũng có biểu hiện giống chuột ở lô độc. Khoảng 1 giờ sau khi gây độc, tiếp tục cho uống cao chiết thì chuột vẫn bình thường, ăn nhiều hơn lô độc nhưng uống nước ít hơn. Trong những ngày thay nước bằng cồn 30 % chuột uống ít. Trọng lượng cơ thể chuột tăng trung bình khoảng 10 – 12 g/con trong suốt 8 tuần. Trong 8 tuần chuột bị chết 1 con ở ngày đầu cho uống thuốc do thao tác chưa chuẩn.
- Lô thử cao EtOAc Nghể (L2), chuột sau khi được cho uống CCl4 cũng có biểu hiện tương tự chuột ở lô độc. Khoảng sau 1 giờ chuột được cho uống cao chiết thì trở lại bình thường, ăn nhiều và uống nước khá nhiều. Trọng lượng cơ thể chuột tăng trung bình khoảng 8 -9 g/con trong suốt 8 tuần và không có con nào chết.
Sau 8 tuần chuột được cho uống CCl4 và uống cao chiết, chuột bị cắt đuôi lấy máu để đo enzym gan ALT và AST, mổ lấy gan để giải phẫu vi thể.
•Kết quả đo enzym gan * Kết quả đo hoạt lực ALT
Tiến hành đo hoạt lực enzym ALT theo mục 3.2.3 và thu được kết quả.