4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3.3. Thí nghiệm 3: Sàng lọc invivo cao EtOAc của cây Râu mèo và Nghể
* Thiết kế thí nghiệm
Cho chuột nhịn ăn 18 giờ trước khi uống CCl4.
Các lô được cho uống với liều 0,1 ml/10 g chuột, trong suốt 8 tuần.
- Lo: Chuột được uống dung dịch DMSO 10 %, 2 lần / tuần vào ngày thứ 3, thứ 6. - Lđ: Chuột được uống CCl4 25 % pha trong 0,05 % cholesterol + 20 % mỡ + 10 % DMSO + dầu thực vật, 2 lần / tuần vào ngày thứ 3, thứ 6. Xen kẽ với uống cồn 30 % trong những ngày không uống CCl4.
- L1: Lô thử cao chiết EtOAc Râu mèo. Chuột được cho uống CCl4, cồn tương tự
lô độc. Song song đó chuột sẽ được cho uống 1 mg/ml cao chiết EtOAc cây Râu mèo pha trong 10 % DMSO và nước, được cho uống hàng ngày.
- L2: Lô thử cao chiết EtOAc Nghể. Chuột được cho uống CCl4, cồn tương tự lô
độc. Song song đó chuột sẽđược cho uống 1 mg/ml cao chiết EtOAC cây Nghể pha trong 10 % DMSO và nước, được cho uống hàng ngày.
Bảng 4.6: Bảng thực hiện công việc cho chuột uống CCl4 và cao chiết ở các lô; uống (x), không uống (-). Chất thử nghiệm Lô trắng Lô độc Lô thử Chứng trắng DMSO 10 % x - - Tác nhân gây độc CCl4 25 % + 0,05 % cholesterol + 20 % mỡ + 10 % DMSO + dầu thực vật - x x Cồn 30 % - x x
Thuốc thử Cao chiết - - x
* Đánh giá kết quả
3 ngày sau khi chuột uống liều CCl4 cuối cùng, lấy máu ở đuôi chuột, ly tâm lấy huyết tương để tiến hành đo enzym gan ALT, AST. Sau đó mổ chuột lấy gan để xét nghiệm mô học.
•Nhận xét biểu hiện của chuột trong các lô thử nghiệm
Tiến hành thử nghiệm sinh học theo mục 3.2.3 trong 8 tuần. Quan sát chuột ở các lô thử nghiệm, ta thấy biểu hiện của chuột như sau:
- Lô chứng trắng (Lo), chuột được uống dung dịch DMSO 10 % có các biểu hiện
ăn uống bình thường (Hình 4.4). Trọng lượng cơ thể tăng đồng đều và không có con nào chết trong suốt 8 tuần.
- Lô độc (Lđ), chuột được cho uống CCl4 khoảng 15 phút sau có biểu hiện mắt lừ đừ, mệt lả, thở dốc, có những con chạy nhảy loạn xạ, khoảng sau 30 phút thấy lông chuột xù, bám lại với nhau, đổ mồ hôi ở dưới hầu của chuột (Hình 4.5). Một giờ sau chuột trở
những ngày thay nước bằng cồn 30 % chuột uống ít. Trọng lượng cơ thể chuột trong tuần
đầu bị giảm, sau đó tăng trở lại và suốt 8 tuần trọng lượng cơ thể chuột tăng ít, trung bình khoảng 6 – 7 g/con, có một vài con gần như không tăng cân so với lúc đầu.
- Lô thử cao EtOAc Râu mèo (L1), chuột sau khi được cho uống CCl4 cũng có biểu hiện giống chuột ở lô độc. Khoảng 1 giờ sau khi gây độc, tiếp tục cho uống cao chiết thì chuột vẫn bình thường, ăn nhiều hơn lô độc nhưng uống nước ít hơn. Trong những ngày thay nước bằng cồn 30 % chuột uống ít. Trọng lượng cơ thể chuột tăng trung bình khoảng 10 – 12 g/con trong suốt 8 tuần. Trong 8 tuần chuột bị chết 1 con ở ngày đầu cho uống thuốc do thao tác chưa chuẩn.
- Lô thử cao EtOAc Nghể (L2), chuột sau khi được cho uống CCl4 cũng có biểu hiện tương tự chuột ở lô độc. Khoảng sau 1 giờ chuột được cho uống cao chiết thì trở lại bình thường, ăn nhiều và uống nước khá nhiều. Trọng lượng cơ thể chuột tăng trung bình khoảng 8 -9 g/con trong suốt 8 tuần và không có con nào chết.
Sau 8 tuần chuột được cho uống CCl4 và uống cao chiết, chuột bị cắt đuôi lấy máu để đo enzym gan ALT và AST, mổ lấy gan để giải phẫu vi thể.
•Kết quả đo enzym gan * Kết quả đo hoạt lực ALT
Tiến hành đo hoạt lực enzym ALT theo mục 3.2.3 và thu được kết quả.
Bảng 4.7: Kết quả đo hoạt lực ALT của các lô thử nghiệm
Kết quả ở biểu đồ 1 cho thấy
- Lô chứng trắng (Lo), do chuột không bị gây độc bằng CCl4 nên hoạt lực ALT bình thường.
- Lô độc (Lđ), có enzym gan tăng rất cao so với lô chứng trắng. Chứng tỏ ở nồng
độ này CCl4đã gây độc tế bào gan làm phóng thích enzym gan.
- Lô thử cao EtOAc của cây Râu mèo (L1), có tỉ lệ hạ enzym gan giảm 2.55 lần so với lô độc, cho thấy các chất chứa trong cao EtOAc Râu mèo có tác dụng làm hạ
enzym gan.
- Lô thử cao EtOAc của cây Nghể (L2), có tỉ lệ hạ enzym gan giảm 2.64 lần so với lô độc và là lô có hoạt lực ALT giảm mạnh, cho thấy các chất chứa trong cao EtOAc Nghể có tác dụng làm hạ enzym gan rất tốt khi gan bị nhiễm độc CCl4.
Lo Lđ L1 L2
Hoạt lực ALT (U/L) 29.7 ± 11.6205 81.4 ± 18.9762 31.9 ± 15.8492 30.8 ± 7.993
% enzyme giảm so với lô độc 60.81 % 62.16 %
Biểu đồ 1: Biểu diễn hoạt lực ALT 0 20 40 60 80 100 120 Lo Lđ L1 L2 Lô Ho ạ t độ A L T (U /L )
Nhận xét: Theo kết quả trên ta nhận thấy chuột ở lô độc (Lđ) có hoạt lực enzym gan ALT tăng cao gấp mấy lần chuột ở các lô thử nghiệm. Chuột ở lô thử cao EtOAc Nghể
(L2) tỉ lệ hạ enzym gan ALT thấp hơn chuột ở lô thử cao EtOAc Râu mèo (L1).
* Kết quảđo hoạt lực AST
Tiến hành đo hoạt lực enzym AST theo mục 3.2.3 và thu được kết quả
Bảng 4.8: Kết quả đo hoạt lực AST của các lô thử nghệm
Lo Lđ L1 L2
Hoạt lực AST (U/L) 26 ± 10.507 70 ± 12.962 18 ± 17.7989 16 ± 8.19756
% enzyme giảm so với lô độc 74.29 % 77.14 %
Tỉ lệ giảm so với lô độc (lần) 3.89 4.375 Lô Lo: 29.7 ± 11.6205 a U/L
Lô Lđ: 81.4 ± 18.9762 b U/L. Lô L1: 31.9 ± 15.8492 a U/L Lô L2: 30.8 ± 7.993 a U/L. (Kết quả trắc nghiệm phân hạng ở mức ý nghĩa 0,00) Ho ạ t l ự c A LT (U /L)
Kết quả ở biểu đồ 2 cho thấy
- Lô chứng trắng (Lo), do chuột không bị gây độc bằng CCl4 nên hoạt lực AST bình thường
- Lô độc (Lđ), cũng có enzym gan tăng rất cao so với lô chứng trắng, chứng tỏ ở
nồng độ này CCl4 sử dụng trong thử nghiệm có tác dụng gây độc tế bào gan làm phóng thích enzym gan.
- Lô thử cao EtOAc Râu mèo (L1), có tỉ lệ hạ enzym gan giảm 3.89 lần so với lô
độc, enzym gan thấp hơn cả lô chứng trắng, cho thấy các chất chứa trong cao EtOAc Râu mèo có tác dụng lên gan rất hữu hiệu và không gây ra các bệnh lý trong quá trình uống cao chiết.
- Lô thử cao EtOAc Nghể (L2), có tỉ lệ hạ enzym gan giảm 4.375 lần so với lô
độc, thấp hơn lô chứng trắng, cho thấy các chất chứa trong cao EtOAc Nghể có tác dụng làm hạ enzym gan tốt.
Biểu đồ 2: Biểu diễn hoạt lực AST
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Lo Lđ Lô L1 L2 Ho ạ t độ AST ( U /L ) Ho ạ t l ự c A S T ( U /L )
Lô Lo: 26 ± 10.507 a U/L Lô Lđ: 70 ± 12.962 b U/L. Lô L1: 18 ± 17.7989 a U/L Lô L2: 16 ± 8.19756 a U/L. (Kết quả trắc nghiệm phân hạng ở mức ý nghĩa 0,00)
Nhận xét: Theo kết quả trên ta nhận thấy chuột ở lô độc có enzym gan AST tăng cao gấp mấy lần chuột ở các lô thử nghiệm còn lại. Chuột ở lô thử cao EtOAc Râu mèo có enzym gan AST thấp hơn chuột ở lô thử cao EtOAc Nghể.
¾ Kết luận
Qua kết quả đo enzym gan ALT và AST ta thấy lô thử cao EtOAc của cây Râu mèo và lô thử cao EtOAc của cây Nghể có tác dụng rất tốt trong việc làm hạ enzym gan khi gan chuột bị nhiễm độc bởi CCl4.
Cao chiết EtOAc của cây Râu mèo và Nghể có hiệu quả loại các gốc tự do được tạo ra bởi CCl4, nên có kết quả làm giảm tác dụng độc của chất độc CCl4in vivo. Các hợp chất này có thể ứng dụng trong việc ngăn chặn tác dụng gây độc của CCl4 trên cơ thể sinh vật. Vậy cao EtOAc của cây Nghể và cây Râu mèo có tác dụng làm hạ enzym gan mãn tính ở nồng độ 1 mg/ml. Từ nồng độ thử này, trong các khảo sát tiếp theo nên thửở nồng
độ thấp hơn để dò tìm liều thấp nhất có tác dụng.
•Kết quả đánh giá xơ gan
Tiến hành xét nghiệm mô học theo mục 3.2.3 và thu được kết quả
Kết quả
- Quan sát gan chuột ở các lô thử nghiệm bằng mắt thường khi mổ ổ bụng chuột.
- Lô chứng trắng (Lo), gan chuột có màu sắc bình thường màng phía ngoài bóng, không có lỗ nhỏ hay khối u.
- Lô độc (Lđ), gan chuột cũng có màu đỏ hơn gan bình thường nhưng màng phía ngoài bị khô.
- Hai lô thử cao EtOAc của cây Râu mèo (L1) và cây Nghể (L2), gan bình
thường giống như gan chuột ở lô trắng. - Kết quả giải phẫu vi thể
- Lô chứng trắng (Lo), lô thử cao EtOAc của cây Râu mèo (L1) và cây Nghể (L2), có các tế bào gan, khoang cửa gan của chuột có hình thái bình thường. Không có hiện tượng hoại tử (Hình 4.6, 4.8, 4.9).
- Lô độc (Lđ), gan chuột có hình thành xơ (mũi tên Hình 4.7), tế bào gan chuột bị tổn thương (Hình 4.7).
Khi CCl4 vào cơ thể sẽ được chuyển hóa nhờ Cyt P450, sinh ra gốc tự do làm xáo trộn các phản ứng sinh hóa trong cơ thể, làm tổn thương gan không thể phục hồi dẫn
đến bệnh viêm gan mãn tính. Bệnh viêm gan lâu dần sẽ gây ra bệnh xơ gan do các tế bào hình sao được hoạt hóa, tổng hợp các collagen trong chất nền ngoại bào. Qua kiểm tra mô học – giải phẫu vi thể bằng kỹ thuật nhuộm màu thấy gan bị tổn thương và bị xơở lô độc, lô thử cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể gan không bị tổn thương và không bị xơ.
¾ Kết luận
Qua kết quả giải phẫu vi thể cho thấy gan chuột ở lô độc bị xơ, gan chuột ở các lô thử cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể không bị xơ. Các hợp chất có trong cao EtOAc của hai cây này có hiệu quả trong việc loại các gốc tự do tạo ra trong gan chuột nhiễm độc CCl4, tế bào gan không bị tổn thương, tế bào hình sao không bị kích hoạt nên
không hình thành xơ ở gan.. Kết luận cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể có tác dụng ức chế xơ gan trong điều kiện thử nghiệm.
Kết luận
Qua khảo sát các cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể trên gan chuột bị gây
độc bằng CCl4, nhận thấy.
- Lô chứng trắng (Lo), chuột có enzym gan bình thường, gan chuột không bị tổn thương và dung dịch DMSO 10 %, thức ăn, nước uống không ảnh hưởng tới gan.
- Lô độc (Lđ), chuột có enzym gan tăng cao, gan chuột bị xơ, bị tổn thương do CCl4 và cồn 30 %.
- Lô thử cao EtOAc của cây Râu mèo (L1), chuột có enzym gan giảm so với chuột ở lô độc (Lđ). Chứng tỏ cao chiết EtOAc của cây Râu mèo ở nồng độ 1 mg/ml có tác dụng làm hạ enzym gan và ức chế xơ gan khi thử nghiệm trên mô hình in vivoở gan chuột bị nhiễm độc CCl4.
- Lô thử cao EtOAc của cây Nghể (L2), chuột có enzym gan giảm so với chuột ở
lô độc (Lđ). Chứng tỏ cao chiết EtOAc của cây Nghểở nồng độ 1 mg/ml có tác dụng làm hạ enzym gan và ức chế xơ gan khi thử nghiệm trên mô hình in vivoở gan chuột bị nhiễm