2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIấN CỨ U
3.2.2.Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng thớ nghiệ m
3.2.2.1 Phương phỏp ủiều chế mụi trường WA, PDA, Pepton
* Mụi trường WA - Thành phần Agar: 20g
Nước cất: 1000ml
- Phương phỏp ủiều chế: Nước cất ủun sụi, cho Agar vào khuấy ủều cho tan hết. ðổ mụi trường vào bỡnh hấp ở ủiều kiện 1210C, 1,5 atm trong thời gian 30 phỳt. ðể nguội ủổ vào ủĩa Petri ủó vụ trựng.
* Mụi trường PGA - Thành phần:
Agar: 20g Khoai tõy: 200g
Glucoza: 20g Nước cất: 1000ml
- Phương phỏp ủiều chế mụi trường: Khoai tõy rửa sạch, thỏi thành từng miếng vuụng khoảng 1 cm, cho vào nồi ủó cú 400-500ml nước cất, ủun sụi ủến khi mềm, lọc bằng lưới lọc, cho ủủ 1 lớt rồi cho gluco, agar vào, khuấy
ủều cho tan hết. ðổ dung dịch vào bỡnh, ủem hấp vụ trựng ở ủiều kiện 1210C trong 30 phỳt. Sau ủú ủể nguội ủem ủổ ra ủĩa Petri vụ trựng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...29
3.2.2.2 Phương phỏp phõn lập nấm
- Dựa vào triệu chứng: thu thập mẫu lỏ, thõn, rễ bị bệnh ủem về phõn tớch giỏm ủịnh trong phũng.
- Kiểm tra nấm hại bằng phương phỏp ủặt ẩm: dựng ủĩa Petri nhựa cú lút giấy thấm ủó ủược thấm nước cất, sau ủú ủặt mẫu bệnh vào, ghi rừ tờn cõy, ngày ủặt. Sau 7 ngày cú thể kiểm tra dưới kớnh hiển vi soi nổi hoặc khờu nấm ra lam kớnh ủể kiểm tra.
- Phõn lập nấm trờn mụi trường nhõn tạo: WA, PGA (Mathur và cộng sự, 2000). Lưu giữ và bảo quản cỏc dũng thuần.
3.2.2.3 Phương phỏp tỏch lọc tuyến trựng từ mẫu ủất
Trộn ủều từng mẫu ủất, dàn mỏng trờn giấy, vạch thành 2 ủường chộo và lấy ủủ 100g ủất/mẫu sau ủú ủem phõn tớch theo phương phỏp phễu lọc của Bearmann (Moens, 1995). Dựng phễu lọc cú ủường kớnh 5-10cm ủặt trờn một giỏ ủỡ, ủoạn dưới phễu nối với 1 ống cao su cú van ủúng mở và nối với một
ống thuỷ tinh. Cho mẫu ủất vào trong phễu cú sẵn lưới lọc 100-120àm ủổ
ngập nước ngõm trong 24-48h sau ủú thu thập tuyến trựng ở ủỏy ống. Cú thể
thay thế phễu thuỷ tinh bằng khay nhựa: dựng khay cú lỗ thủng ủặt lưới lọc 100-120àm trong khay và cho 100g ủất dàn ủều trờn mặt lưới lọc. ðặt khay này trong khay khỏc khụng thủng ủỏy, ủổ nước ngập ủều mẫu ủất và giữ trong 24 - 48h sau ủo thu tuyến trựng qua một rõy lọc 25àm. Chỳ ý khi lọc cần lút một tờ giấy thấm vào ủỏy phễu trỏnh tạp chất lẫn vào. Dựng kớnh soi nổi xỏc
ủịnh mật ủộ tuyến trựng và dựng kớnh hiển vi ủể phõn lập tuyến trựng.
3.2.2.4 Phương phỏp tỏch lọc tuyến trựng từ rễ
Tuyến trựng trong rễ ủược tỏch lọc bằng phương phỏp lọc qua rõy (Maceration sieving Method).
Rửa sạch mẫu dưới vũi nước mạnh, ủể khụ rồi cắt thành từng ủoạn 0,5- 1cm. Trộn ủều rồi cõn 5g rễ cho vào cối cú chứa ớt nước ủể gió nhỏ hoặc cú thể cho vào may xay sinh tố cú chứa 100ml nước, xay 3 lần, mỗi lần 10 giõy, sau mỗi lần nghỉ 5 giõy. Cho dịch xay qua rõy 500àm-100àm và thu thập
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...30
tuyến trựng trờn rõy 45àm. Cỏc thớ nghiệm tiến hành
Thớ nghiệm 1. Nghiờn cứu khả năng ủối khỏng của vi khuẩn Bacillus filaris với một số loại nấm, vi khuẩn gõy bệnh.
Cấy cỏc nấm vi khuẩn gõy bệnh, ủồng thời với vi khuẩn Bacillus filaris
trờn mụi trường thớch hợp theo dừi sự phỏt triển của tản nấm sau 4, 10 ngày.
Thớ nghiệm 2: So sỏnh khả năng phũng trừ nấm Sclerotium rolfsii của
Trichoderma viride và T.harzianum
CT1: Chỉ cấy S. rolfsii (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CT2: Cấy S. rolfsii trước, cấy T. viride sau 1 ngày CT3: Cấy S. rolfsii và T. virideủồng thời.
CT4: Cấy T. viride trước, cấy S. rolfsii sau 1 ngày CT5: Cấy S. rolfsii trước, cấy T. harzianum sau 1 ngày
CT6: Cấy S. rolfsii và T. harzianumủồng thời CT7: Cấy T. harzianum trước, cấy S. rolfsii
Chỉ tiờu theo dừi: ðường kớnh tản nấm (mm) Mỗi cụng thức lặp lại 3 lần
Thớ nghiệm 3. Kiểm tra sự cú mặt của gen khỏng ở thế hệ T2 bằng phương phỏp PCR: Thu mẫu lỏ của cỏc cõy cà chua ở thế hệ T2, tiến hành kiểm tra sự cú mặt của gen khỏng bằng phương phỏp PCR.
Chiết DNA: DNA của cõy cà chua chuyển gen ủược chiết bằng CTAB. Cỏc bước tiến hành chạy PCR: phản ứng PCR ủược thực hiện bằng cặp mồi Hypsys F/R phỏt hiện ủoạn gen chuyển với kớch thước 420nst. Phản ứng
ủược thực hiện với DreamTaq (hóng Fermentas) ở nhiệt ủộ gắn mồi là 520C. Sản phẩm PCR ủược kiểm tra bằng ỏnh sỏng tử ngoại và chụp bằng mỏy ảnh số.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...31