2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIấN CỨ U
2.2. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trong nướ c
2.2.1. Cà chua chuyển gen
Mụ sẹo giữ vai trũ quan trọng trong chuyển gen cõy trồng trờn cõy một và hai lỏ mầm, là một chỉ tiờu trong chuyển gen thụng qua vi khuẩn
Agrobacterium-làm trung gian chuyển DNA hoặc qua phương phỏp bắn gen trực tiếp vào tế bào thực vật nhờ sỳng bắn gen. Phương phỏp chuyển gen trờn cỏc loại cõy trồng quan trọng như: lỳa, ngụ, cà chua, ủậu tương, thuốc lỏ, lỳa mạch, dầu cải, bụng,Ầcú thể sử dụng mụ sẹo ở một số bước trong toàn bộ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...16
quỏ trỡnh chuyển gen cho ủặc ủiểm từng loại cõy nhưng khụng loại trừ kể cả
chuyển gen tạo ra cỏc giống khỏng cụn trựng, khỏng bệnh hại và thuốc trừ cỏ, làm tăng năng suất cõy trồng, tăng khả năng chống chịu mụi trường bất lợi (núng, lạnh, mặn, khụ hạn), hạt giống chuẩn (tăng hoặc giữ ủảm bảo hàm lượng dầu, tinh bột, ủạm).
Theo kết quả nghiờn cứu của Ngụ Thị Xuyờn (2001-2002) [12], hai giống cà chua Motell và VFN-Roma chứa gen khỏng Mi ủược thực hiện khảo nghiệm khả năng lõy nhiễm cả 2 nguyờn nhõn gõy bệnh TTNS M. incognita
và nấm S. rolfsii theo cụng thức lõy ủơn và lõy hỗn hợp ở lần lõy nhiễm lần thứ nhất thỡ cả 2 giống này hầu như khụng nhiễm tuyến trựng nốt sưng M. incognita (R-resistant) và cũng khụng biểu hiện triệu chứng bệnh hộo rũ gốc mốc trắng (S. rolfsii). Kết quả lõy nhiễm lần 1 mức ủộ nhiễm TTNS M. incognita và nấm S. rolfsii là rất nhẹ (<1%) và hầu như khụng biểu hiện triệu chứng bệnh trong suốt giai ủoạn sinh trưởng và phỏt triển của cả 2 giống cà chua. Ở lần lõy nhiễm thứ 2 khi trồng cà chua trờn ủất ủú lõy nhiễm lần 1 cho kết quả khả năng nhiễm TTNS M. incognita và nấm S. rolfsii cao hơn hẳn. Cả
2 giống Motell và VFN-Roma nhiễm >10% ở cụng thức lõy riờng tuyến trựng, cũn khi lõy hỗn hợp thỡ tỷ lệ bệnh chiếm 12,6-23,7%. TLB hộo rũ gốc mốc trắng biểu hiện nhẹở cụng thức lõy riờng <1% trờn giống Motell và >2% trờn giống VFN-Roma nhưng khi lõy hỗn hợp thỡ TLB chiếm 12,6-23,7%. Tuyến trựng tuổi 2 (M. incognita) cũng tăng theo thời gian lõy nhiễm, ủặc biệt ở lần lõy nhiễm thứ 2 thỡ số lượng mật ủộ tuyến trựng/100g ủất ủạt > 100 con vượt quỏ mức gõy hại. Như vậy cả 2 giống chứa gen khỏng Mi ủều nhiễm TTNS
M. incognita và nấm S. rolfsii ở mức nhiễm nhẹ và trung bỡnh. Trong ủiều kiện lõy nhiễm lần ủầu tại Việt Nam 2 giống này vẫn là những giống cú khả
năng khỏng TTNS và nấm gõy bệnh hộo rũ gốc mốc trắng.
Kết quả nghiờn cứu của Ngụ Thị Xuyờn và Martha L Orozco-Cỏrdenas (Ngụ Thị Xuyờn, Martha L Orozco-Cỏrdenas 2009) [21], Terminal flower 1 (TFL1) là một gen quyết ủịnh quan trọng thời gian ra hoa trờn cõy dầu cải
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...17
Arabidopsis và cỏc loài thảo mộc khỏc. Promoter của gen TFLủược phõn lập từ giống cam lõu năm navel ỘWashingtonỢ (Citrus sinensis L. Osbeck). Vector biểu hiện trong thực vật ủú ủược thiết kế bao gồm 1544bp của promoter TFLủặt trước gen β -glucuronidase (GUS) ủể phõn tớch sự biểu hiện
ủặc hiệu theo khụng gian (cỏc mụ khỏc nhau) và ủặc hiệu thời gian (cỏc giai
ủoạn phỏt triển) của promoter CsTFL trong cõy cà chua chuyển gen (Solanum lycopersicon, cv.microtom). GUS hiển thị rất tốt ở 4 bộ phận: hoa, quả xanh, quả chớn và hạt cũn non, kết quả biểu hiện ở hạt non khỏc với kết quả biểu hiện ở trờn cam trước ủú. Biểu hiện của gen GUS cũn ủược phỏt hiện ở phần ngọn và thõn cõy non, ủặc biệt trong mụ mạch nhưng khụng cú trong lỏ cõy. Kết quả này ủú chỉ ra rằng biểu hiện của promoter của gen CsTFL thể hiện tớnh ủặc hiệu mụ và giai ủoạn phỏt triển trong cà chua tương tự như trờn cõy cam. Cõy cà chua chuyển gen TFL ủược phõn lập từ giống cam lõu năm navel ỘWashingtonỢ tại Hoa Kỡ trờn thế hệ T1, ủó ủược Ngụ Thị Xuyờn khảo sỏt tại Việt Nam về khả năng chống chịu bệnh, từ ủú cú thể sử dụng làm vật liệu khởi ủầu ủể thực hiện cỏc bước tiếp theo trong việc lai tạo giống và ứng dụng tại Việt Nam do gen ủược chuyển tạo vỏ dày, mụ cứng.
Ngụ Thị Xuyờn (2010) [22] ủó nghiờn cứu tớnh chống chịu với bệnh hỗn hợp giữa tuyến trựng nốt sưng và nấm của một số dũng cà chua chuyển gen khỏng và cà chua trồng phổ biến. Kết quả cho thấy cỏc giống chuyển gen To-Hypsys #38, TPL#11, Physilk#4 và VPN (Roma)-Mi cú hiệu quả chống chịu bệnh hỗn hợp rừ rệt so với giống TVP-134 và giống cà chua ghộp trờn gốc cà bỏt VL2000/EG203, tỉ lệ bệnh 1,5-4,9%. Cỏc giống tạo mụ dày như
Physilk, giống khỏng nhiễm tạo liền vết thương To-Hypsys #38 cú tớnh khỏng cao với số lượng tỳi trứng nhỏ hơn 50 tỳi trứng/bộ rễ.
Nguyễn Khắc Tiệp (2010) [8] ủó nghiờn cứu sự biểu hiện của tiểu ủơn vị B ủộc tố cholera (CTB) trong cõy cà chua. Gen mó húa CTB thớch hợp với thực vật ủược dung hợp với trỡnh tự SEKDEL và tạo dũng trong vector biểu hiện bờn cạnh promoter CaMV 35S. Gen CTB sau ủú ủược biến nạp vào cõy
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...18
cà chua thụng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Khuếch ủại DNA bằng phản ứng PCR ủó chứng minh sự cú mặt của CTB trong cà chua. đõy cú thể là cơ sở cho việc phỏt triển mụ hỡnh vaccine thực vật sau này.
2.2.2. Bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm
Bệnh hộo rũ gốc mốc trắng ủó ủược nghiờn cứu ở nước ta, ủược xỏc
ủịnh do nấm Sclerotium rolfsii Sacc. gõy ra. Từ vết bệnh cú những ủỏm sợi nấm trắng xốp như bụng bao phủ. Từ cỏc sợi nấm hỡnh thành nờn cỏc hạch nấm kớch thước 0,5-1mm. Ban ủầu hạch nấm màu trắng, sau chuyển sang màu vàng và cuối cựng là màu nõu. Hạch nấm là nguồn bệnh của năm sau (Nguyễn Kim Võn, 2007) [9].
Theo Ngụ Thị Xuyờn (2007a) [19], tuyến trựng nốt sưng phõn bố rộng trong tự nhiờn ở nhiều vựng và trờn rất nhiều loại cõy trồng làm giảm năng suất cà chua, thuốc lỏ, bạch truật, ngưu tất, bạch chỉ, hồ tiờu, cà phờ, cà phỏo, cà bỏt, ớt, bầu bớ, hoa mào gà, mồng tơi, dền, cỏ xước, cải bắp, su hào, dứa, khoai tõy, chuối... ở Hà Nội, Lạng Sơn, Hải Phũng, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Trị, đắc Lắc, Gia Lai, Lõm đồng, Tp. Hồ Chớ Minh... Tuyến trựng M. incognita thường gõy hại trờn ủất nhẹ, tơi xốp.
Tuyến trựng M. incognita xõm nhập bộ rễ ngay từ giai ủoạn ủầu, tạo u sưng, cú kớch thước lớn nhỏ, nối tiếp nhau tạo thành chuỗi hoặc từng u sưng riờng biệt. Tuyến trựng ký sinh trong rễ cõy ký chủ, khi xõm nhập vào bờn trong mụ tế bào rễ (tuyến trựng tuổi 2) tuyến trựng khụng di chuyển ủi cỏc bộ
phận khỏc của cõy ký chủ, tiết ra cỏc men và cỏc chất kớch thớch sinh trưởng làm cho tế bào rễ sinh sản quỏ ủộ, phỡnh to, tạo ra cỏc u sưng to nhỏ khỏc nhau thành chuỗi ở trờn rễ. U sưng ủược hỡnh thành sau 1-2 ngày, một số cõy trồng (bụng) hỡnh thành u sưng chỉ sau 24 giờ. Cõy bị bệnh cũi cọc, vàng ỳa, chết hộo, biến dạng, rễ thối hỏng, triệu chứng bệnh rất dễ bị nhầm lẫn với cỏc triệu chứng do cỏc nguyờn nhõn khỏc gõy ra.
Kết quảủiều tra của Ngụ Thị Xuyờn (2003b) [14] cho thấy hầu hết cỏc vựng trồng cõy dược liệu ủều xuất hiện bệnh tuyến trựng nốt sưng và tuyến
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...19
trựng M. incognita xõm nhiễm phỏ hủy toàn bộ rễ ở mức nhiễm nặng. Cõy bỡnh thường chỉ hỡnh thành từ 1-3 rễ củ, cõy bị bệnh cú tới hơn chục rễ nhỏ, u sưng tạo thành từng chuỗi, cỏc nốt sưng xốp, mọng nước, khi sấy củ thỡ cỏc nốt sưng teo ủi làm giảm ủỏng kể khối lượng khụ của củ. Cõy bị bệnh thỡ cỏc chỉ tiờu cấu thành năng suất biến ủổi ủỏng kể, cụ thể tăng ủường kớnh củ, tăng trọng lượng tươi của củ, giảm chiều dài củ. Sự biến ủổi này ủó giảm 35% năng suất, ngoài ra cũn giảm chất lượng của củ như giảm hàm lượng ủường tổng số, ủạm tổng số, hàm lượng protein và giảm mẫu mó khi xuất khẩu, gõy thiệt hại lớn về kinh tế cho nghề trồng cõy dược liệu ở nước ta.
Theo kết quảủiều tra của Nguyễn Văn đĩnh, Ngụ Thị Xuyờn, Nguyễn Thị Kim Oanh (2004) [2] tại Lĩnh Nam Ờ Hoàng Mai Ờ Hà Nội cho thấy nhiều hộ sản xuất thường trồng gối vụ hoặc xen canh liờn tiếp cỏc loại cõy trồng nờn
ủất thường khụng ủược cày lật lờn sau mỗi vụ, ở ủõy nhúm bệnh hại vựng rễ
phỏt triển mạnh hơn. Tuyến trựng trong ủất cú xuất hiện và gõy hại nhưng khụng ủược người nụng dõn chỳ ý ủến và chưa thực hiện phũng trừ.
Trong thực tế cõy cà chua khụng thể trỏnh khỏi những thiệt hại do cỏc tỏc nhõn gõy bệnh như tuyến trựng nốt sưng và một số bệnh hộo khỏc (hộo xanh, hộo vàng, virus xoăn ngọn, mốc xỏm và bệnh mốc sương). đối tượng tuyến trựng gõy hại là ủối tượng quan trọng cú ý nghĩa kinh tế trong sản xuất cà chua, ủặc biệt khi TTNS xuất hiện sớm hoặc khi trờn cõy cú cả 2 tỏc nhõn TTNS và một số vi sinh vật gõy bệnh trong cựng một thời ủiểm (Ngụ Thị
Xuyờn, 2003a) [13].
Kết quả ủiều tra của Ngụ Thị Xuyờn và ctv (2001-2002) [12] theo dừi trờn nhiều giống cà chua trồng phổ biến ở một số tỉnh phớa Bắc cho thấy TTNS M. incognita và nấm S. rolfsii xuất hiện và gõy hại ủỏng kể trờn nhiều giống cà chua ở đụng Anh, Từ Liờm, Gia Lõm (Hà Nội); Văn Giang, Khoỏi Chõu (Hưng Yờn); Vừ Cường (Bắc Ninh); thị xó Bắc Giang và Lục Nam (Bắc Giang). Những giống cà chua trồng ủó lõu năm như CS-1, P375, Hồng Ba Lan, TS-19 và 2 giống MV-1, VL-2000 trồng chủ yếu trong một số năm vừa
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...20
qua vẫn là những giống nhiễm tuyến trựng nốt sưng M. incognita và nấm S. rolfsii làm giảm năng suất và thậm chớ khụng cho thu hoạch cà chua như ở đụng Anh và Văn Giang.
Ngụ Thị Xuyờn (2003a) [13] ủiều tra trờn cỏc giống cà chua trồng phổ
biến (P-375, CS-1, MV-1, Phỏp, Ba Lan Hồng, Mỹ) trong nhiều vụ và giống thử nghiệm (TL-009, CL-93, CL-204, CTS-386, MV-1/EG-203, TL-009/EG- 203) ủều bị nhiễm TTNS M. incognita. Bệnh hại từ mức trung bỡnh ủến nặng, tỷ lệ bệnh ủạt 26,5% - 80,6% trờn cà chua vụ sớm, chớnh vụ và vụ muộn 2002 - 2003. Nền ủất cỏt pha và ủất trồng cà chua trong nhiều năm hoặc luõn canh với cõy trồng cạn thỡ nhiễm TTNS nặng và thường xuất hiện cựng với cỏc bệnh khỏc như: hộo xanh (R. solanaccearum), hộo vàng (F. oxysporum), hộo rũ gốc mốc trắng (S. rolfsii), xoăn ngọn (Begomovirus), mốc xỏm (Botrytis cinerea) và thậm chớ cả bệnh mốc sương (Phytophthora infestans). Trờn tất cả
cỏc giống cà chua núi trờn khi lõy nhiễm TTNS M. incognita cho thấy chưa cú giống nào cú khả năng chống chịu với loại tuyến trựng này.
Tuyến trựng M. incognita tạo vết thương cơ giới cho nấm F. solani
(hộo vàng), S. rolfsii (hộo rũ gốc mốc trắng) và vi khuẩn Ralstonia solanacearum xõm nhập sau ủú gõy bệnh làm cho cà chua chết nhanh chúng (Nguyễn Văn đĩnh, Ngụ Thị Xuyờn, Nguyễn Thị Kim Oanh, 2004) [2].
Kết quả ủiều tra của Ngụ Thị Xuyờn, Nguyễn đức Thụy (2003-2004) [16] cho thấy: 131 mẫu trong tổng số 155 mẫu ủiều tra ủó nhiễm bệnh hỗn hợp giữa TTNS và cỏc loại nấm ủất nhưF. oxysporum, R. solani, S. rolfsii và vi khuẩn R. solanacearum chiếm 84,5%.
Theo kết quả ủiều tra của Nguyễn Văn đĩnh, Ngụ Thị Xuyờn và Nguyễn Thị Kim Oanh (2004) [2], cỏc bệnh hộo rũ, ủặc biệt là bệnh hộo xanh thường xuất hiện và gõy hại nặng từ giai ủoạn cõy cà chua ra hoa trở ủi. Tuyến trựng nốt sưng M. incognita là nguyờn nhõn gõy bệnh. đầu tiờn chỳng tạo vết thương cơ giới cho nấm F. solani, S. rolfsii và vi khuẩn R.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...21
solanacearum xõm nhập sau ủú gõy bệnh làm cho cõy cà chua chết nhanh chúng.
Tuyến trựng M. incognita ủược xem là loài gõy hại nghiờm trọng liờn quan với bệnh hộo rũ gốc mốc trắng (S. rolfsii Sacc.) cựng xuất hiện và gõy bệnh trờn cõy cà chua vựng Hà Nội và phụ cận (Ngụ Thị Xuyờn, 2004) [15].
Kết quả ủiều tra của Ngụ Thị Xuyờn (2004) [15] cho thấy trờn cà chua vựng Hà Nội và phụ cận cả 2 bệnh tuyến trựng nốt sưng (M. incognita) và hộo rũ gốc mốc trắng (S. rolfsii) là rất phổ biến, cỏc vựng trồng cà chua bị nhiễm cả 2 bệnh này như: đụng Anh, Gia Lõm, Từ Liờm (Hà Nội); Văn Giang, Khoỏi Chõu, Mỹ Văn (Hưng Yờn); An Hải, Tiờn Lóng (Hải Phũng); Gia Lộc (Hải Dương); Việt Yờn, Thị xó Bắc Giang, Lục Nam (Bắc Giang), Vừ Cường, Thị xó Bắc Ninh (Bắc Ninh). Khi quan sỏt triệu chứng cõy bị bệnh ngoài ủồng ruộng cho thấy cõy cà chua bị bệnh TTNS gõy ra thường xuất hiện ngay từ
giai ủoạn ủầu sau trồng trở ủi nhưng bệnh hộo rũ gốc mốc trắng lại thường xuất hiện sau trồng 2-3 tuần, giai ủoạn cõy ra hoa ủến thu hoạch. Tất cả cỏc giống cà chua trồng phổ biến ở Hà Nội ủều nhiễm TTNS và hộo rũ gốc mốc trắng >15% trở lờn là mức nhiễm làm giảm năng suất ủỏng kể trờn cà chua.
Kết quảủiều tra ngoài ủồng ruộng và cỏc thớ nghiệm lõy bệnh nhõn tạo cũng phản ỏnh khi lõy nhiễm cả 2 loài thỡ càng làm tăng tỷ lệ cõy bị bệnh hộo sau ủú cõy chết nhanh chúng, ủiều này cũng phự hợp và thường xuyờn xuất hiện trờn cỏc giống cà chua trồng phổ biến ở Hà Nội và phụ cận. Cõy bị bệnh lỏ dưới hộo vàng, cõy phỏt triển rất kộm và lỏ hộo cụp, ngay khi cõy cũn xanh thỡ phần gốc thõn ủó cú lớp nấm phỏt triển dày ủặc, hạch nấm hỡnh thành ngay sau khi lớp nấm xuất hiện 1 tuần. Lỳc ủầu hạch nấm màu trắng, sau chuyển dần sang màu vàng và màu nõu hạt cải, nhiều hạch rơi xuống ủất bao phủ
xung quanh gốc thõn. Hạch nấm S. rolfsiiủược hỡnh thành trong tất cả cỏc vụ
trồng cà chua và ngay cả trong những thỏng núng nhất trong năm vào thỏng 7- 8. Vựng ủất trồng rau qua nhiều năm nhưở đụng Anh Ờ Hà Nội, Văn Giang Ờ Hưng Yờn ủó tớch lũy nguồn bệnh gõy bệnh hộo rũ gốc mốc trắng và tuyến
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...22
trựng nốt sưng là phổ biến. Ngoài cõy cà chua cả 2 bệnh này cũn xuất hiện trờn rất nhiều loại cõy trồng khỏc như: thuốc lỏ, ủậu ủỗ, bớ xanh, dưa hấu, cõy dược liệu.
Theo Ngụ Thị Xuyờn (2005) [17] bệnh hỗn hợp do TTNS M. incognita
và nhúm nấm F. solani, R. solani, S. rolfsii cựng vi khuẩn R. solanacearum
luụn thường xuất hiện trờn ủồng ruộng, là những loài cú phổ kớ chủ rộng gõy hại trờn cà chua và nhiều loại cõy trồng cạn khỏc, gõy nờn những thiệt hại
ủỏng kể. Trong cỏc bệnh hỗn hợp giữa TTNS và cỏc loài nấm ủất thỡ tỷ lệ
bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm F. oxysporum chiếm tỷ lệ cao nhất 28,8%. Và biện phỏp phũng trừ bằng chế phẩm sinh học và giống cà chua chứa gen khỏng Mi ủó cú hiệu quả khỏ tốt ủối với bệnh này.
Khi ủiều tra tại 3 vựng trồng cà chua chuyờn canh của Hà Nội và Hưng Yờn cho thấy bệnh hỗn hợp giữa TTNS và bệnh hộo do nấm và vi khuẩn ủều xuất hiện. Cõy phỏt triển kộm suy yếu nhanh dẫn tới cõy chết từ khi ra hoa và