Phytophthora capsici
Sử dụng mô sẹo cấy vào môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch nấm với các nồng độ là 0, 20, 30 và 40%.
B A
Hình 4.1 Mô sẹo hình thành từ lá cây tiêu in vitro trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D. A: Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong
điều kiện tối; B: Mô sẹo tiếp tục đƣợc nuôi cấy ở cƣờng độ ánh sáng nhẹ 50 µmol/m2/s
Tỉ lệ sống
Sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng dịch nấm lỏng lắc, chúng tôi nhận thấy mô sẹo trong nghiệm thức P0 (đối chứng), P1, P2 và P3 vẫn phát triển bình thƣờng và bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng mẫu bị đen ở phần tiếp xúc với môi trƣờng. Tuy nhiên, ở nghiệm thức P0 mô sẹo phát triển hơn hẳn các nghiệm thức còn lại.
Sau 2 tuần nuôi cấy: các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê. Chúng tôi nhận thấy hầu hết các mô sẹo trong môi trƣờng có dịch nấm đều bị đen và môi trƣờng nuôi cấy cũng có màu đen nhạt. Các mẫu bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng chết đen đặc biệt là những phần mô sẹo thì bị đen nhiều. Ở nghiệm
Hình 4.2 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 1 tuần nuôi cấy. P0: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l
2,4-D. P1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 20%. P2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 30%. P3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 40%.
P0 P1
P2 P3
thức đối chứng mẫu sống sót tốt hơn so với các nghiệm thức khác và không có dấu hiệu bị đen. Điều này cho thấy rằng dịch nấm đã có những ảnh hƣởng nhất định đến khả năng sống sót của mô sẹo.
Còn sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng có dịch nấm thì các mẫu mô sẹo ở nghiệm thức P2 và P3 đều bị chết hoàn toàn, chỉ có nghiệm thức P1 mẫu vẫn còn sống nhƣng bên ngoài đều bị đen. Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy có sự rất khác biệt giữa các nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng về phƣơng diện thống kê. Điều này có thể giải thích là nồng độ dịch nấm đã tác động rất lớn đến khả năng sống của mô sẹo và mô sẹo chỉ có thể sống sót ở nồng độ dịch nấm thấp (< 20 %).
P0 P1
P2 P3
Hình 4.3 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 2 tuần nuôi cấy. P0: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1
mg/l 2,4-D. P1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 20%. P2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 30%. P3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 40%.
Bảng 4.1 Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến tỉ lệ sống của mô sẹo Nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Tỉ lệ sống (%)
1 tuần sau cấy 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy
P0 0 100a 100a 100a
P1 20 100a 66,7b 25,0b
P2 30 91,7b 50,0c 0,0c
P3 40 91,7b 33,3d 0,0c
Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05
P1 P0
P2 P3
Hình 4.4 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 3 tuần nuôi cấy. P0: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch
nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%.
Tỉ lệ tạo sẹo
Sau 2 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức P0 và P1 mẫu vẫn tiếp tục tạo sẹo còn lại hai nghiệm thức P2 và P3 thì không tạo sẹo thêm mà mẫu có dấu hiệu đen và chết dần. Mẫu bị đen ở phần tiếp xúc với môi trƣờng và xung quanh mô sẹo nhƣng khi cắt mẫu thì phần bên trong mẫu vẫn còn xanh.
Sau 3 tuần quan sát chúng tôi thấy các nghiệm thức có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê. Hiện tƣợng mẫu mô sẹo chết đen rất rõ và mẫu ở các nghiệm thức đều không tạo sẹo trừ nghiệm thức đối chứng.
Bảng 4.2 Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici lên mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy
Nghiệm thức Dịch nấm (%) Tỉ lệ mô bị đen (%) Tỉ lệ tạo sẹo (%)
P0 0 0,0c 66,7a
P1 20 83,3b 16,7b
P2 30 100a 0,0c
P3 40 100a 0,0c
Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05
Thông thƣờng hiện tƣợng đen của mô sẹo và sự thay đổi màu (bị đen) của môi trƣờng có thể là do hết chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy hay là do nuôi cấy mô sẹo dƣới cƣờng độ ánh sáng cao. Ở đây cả hai nguyên nhân trên đều không phải vì thời gian nuôi cấy chỉ mới 3 tuần (sau khi nuôi cấy khoảng 10 tuần thì dinh dƣỡng trong môi trƣờng mới bắt đầu hết) và điều kiện chiếu sáng khoảng 50 µmol/m2/s (cƣờng độ ánh sáng khá yếu). Mặt khác, ở cùng điều kiện thì ở nghiệm thức không có bổ sung dịch nấm thì hiện tƣợng mô sẹo bị đen và môi trƣờng chuyển màu không xảy ra. Có thể kết luận hiện tƣợng trên là do dịch nấm bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đã ảnh hƣởng đến quá trình phát triển của mô sẹo.
Dịch nuôi cấy nấm Phytophthora capsici chứa các trao đổi chất của nấm
Phytophthora capsici, các hợp chất đó bao gồm các độc tố của loại nấm này đối với ký chủ của loại nấm này. Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, các tế
bào mô sẹo phân chia liên tục, đặc biệt ở các tế bào còn non hiện tƣợng phân chia tế bào rất mạnh mẽ (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Trong quá trình phân chia tế bào sẽ làm cho cấu trúc tế bào kém ổn định. Rất có thể độc tố nấm có trong dịch nấm đã tác động và làm ảnh hƣởng tới quá trình phân bào của mô sẹo. Có thể các tế bào tiếp xúc với môi trƣờng bị đen (các tế bào chết) là do các tế bào này đã tiếp xúc và chịu ảnh hƣởng trực tiếp từ dịch nấm.
Vậy thì có hay không có các phản ứng của tế bào mô sẹo đối với độc tố của nấm Các tế bào mô sẹo sẽ có các phản ứng để chống lại với sự ảnh hƣởng của độc tố nấm. Tế bào sẽ sản sinh ra những chất để chống lại độc tố của nấm. Cơ chế phòng vệ của tế bào mô sẹo có thể là do 2 cơ chế: (1) các chất chống lại tác động của độc tố nấm là do các phản ứng sinh hóa phòng vệ của tế bào để chống chịu lại với các điều kiện bất lợi; (2) các chất chống lại tác động của độc tố nấm đƣợc sinh ra là do sự điều khiển của một gene nào đó. Sự tác động của độc tố nấm lên quá trình phân chia tế bào có thể tạo ra một đột biến giúp tế bào có khả năng chống chịu với độc tố nấm.
Giải phẫu mô sẹo
Các mẫu mô ở các nghiệm thức đều có hình thái giải phẫu giống nhau, các tế bào có cấu trúc, hình dạng đồng đều, nằm sát nhau không tìm thấy sự khác biệt về tế bào sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng có dịch nấm và môi trƣờng không có dịch nấm.
Hình 4.5 Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 1 tuần nuôi cấy trên
Sau 2 tuần nuôi cấy, tiến hành cắt mẫu nhuộm phần mô sẹo trên (phần nằm trên môi trƣờng có màu xanh, trắng hay vàng xám) và phần mô sẹo dƣới (phần tiếp xúc với môi trƣờng). Kết quả nhuộm mẫu cho thấy:
Phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng của tất cả các nghiệm thức đều cho kết quả nhuộm mẫu giống nhau. Các tế bào xếp sát nhau, hƣớng tâm (hƣớng về phần lõi trong của mẫu mô).
Phần mô sẹo nằm dƣới môi trƣờng của nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy có kết quả nhuộm mẫu giống với phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng.
Kết quả nhuộm mẫu mô sẹo phần dƣới của các nghiệm thức có chủng dịch nấm cho kết quả khác biệt so với kết quả nhuộm mẫu của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Các tế bào phía trong gần lõi sắp xếp thƣa hơn còn tế bào ở mép bìa lại xếp dày đặc có kích thƣớc nhỏ hơn, tế bào không đồng đều và kích thƣớc tế bào cũng lớn hơn so với các tế bào phần trên và phần dƣới mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Mặt khác, cũng có sự khác biệt giữa các tế bào trong từng nghiệm thức, ở nghiệm thức nồng độ dịch nấm 20 % các tế bào có kích thƣớc và hình dạng gần với nghiệm thức đối chứng, ở nồng độ dịch nấm 30 % và 40 % tế bào có kích thƣớc khác so với các nghiệm thức dịch nấm 20 % và đối chứng.
Sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng dịch nấm, tiến hành cắt và nhuộm mẫu mô sẹo. Mẫu ở nghiệm thức P2 và P3 đã bị đen và chết hoàn toàn nên không giải phẫu đƣợc bởi mô bị mềm và rã ra. Do đó, chỉ có hình của hai nghiệm thức đối chứng và P1. Hình thái tế bào ở nghiệm thức đối chứng vẫn không có sự thay đổi còn nghiệm thức có dịch chiết nấm 20% cấu trúc tế bào không đồng đều (to, nhỏ, tròn ,méo) và các tế bào rời rạc.
P0
Hình 4.7 Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng đối chứng (P0) và môi trƣờng P1 sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40 10). P0: Môi trƣờng có
bổ sung dịch nấm 0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%.
P1 P0
Hình 4.6 Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40 10). P0: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm
0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%.
P2 P3