3.3.1.1. Phòng chuẩn bị môi trƣờng
Nồi hấp: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy, tủ lạnh bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ, bể rửa chai, ống nghiệm, bếp điện, cân phân tích, máy khuấy từ, máy đo pH và bình 250 ml.
3.3.1.2. Phòng cấy
Tủ cấy vô trùng, đèn cực tím, giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy, các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng.
3.3.1.3. Phòng cấy nấm
Tủ cấy nấm, đèn cực tím và các dụng cụ cấy gồm: dao, que cấy, đèn cồn, bình phun, giấy thấm.
3.3.1.4. Phòng tăng trƣởng
Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy (0,6 x 2 m), trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2 m.
Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20C, nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây, ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây.
3.3.2. Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy
Mẫu cấy: Mô sẹo và chồi của cây tiêu Vĩnh Linh
Điều kiện nuôi cấy: cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s. Nhiệt độ 26 2oC và ẩm độ 60 – 80%. Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày.
3.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm là:
MS (Murashige và Skoog, 1962), gồm các thành phần sau:
Nguyên tố đa lượng
NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l CaCl2.2H2O 440 mg/l Vitamins Inositol 100 mg/l Nicotinic 0,5 mg/l Pyridoxin HCl 0,5 mg/l Thiamin HCl 0,1 mg/l Glyxin 2 mg/l Nguyên tố vi lượng H3BO3 6,2 mg/l MnSO4.4H2O 22,5 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l KI0,83 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l Fe EDTA FeSO4.7H2O 27,8 mg/l Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/l Các chất khác:
Đƣờng sucrose: 30 g/l, agar: 8,5 g/l và pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8
Các chất điều hòa sinh trưởng: BA (N6-benzyladenine), IBA (Indole-3- butyric acid), TDZ (Thidiazuron), 2,4D (Dichlophenoxy acetic acid).
3.3.4. Các công thức xử lý chiếu xạ
Đồng vị phóng xạ nhân tạo Co60 đƣợc sử dụng là nguồn phát xạ gamma tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt.
Tia γ có bản chất sóng điện từ, có bƣớc sóng ngắn nên không bị lệch hƣớng khi đi qua điện từ trƣờng và có khả năng đâm xuyên rất lớn.
Trong xử lý phóng xạ ngƣời ta dùng hai đơn vị để đo lƣờng phóng xạ:
Rad: để đo năng lƣợng hấp thụ. Rad là liều lƣợng bức xạ bất kỳ loại nào tạo ra trong môi trƣờng vật chất mà tia phóng xạ đó truyền qua.
Roentgen (Г): đơn vị dùng để đo năng lƣợng phát xạ của tia ion có bản chất là sóng điện từ (tia X và tia γ)
Tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt vào thời điểm tiến hành thí nghiệm cuối tháng 06/2007 máy phát xạ tia γ hoạt động với các thông số sau:
Suất liều phát xạ tại chỗ:
Liều đỉnh : 13,38 rad/giây. Liều trung tâm : 19,22 rad/giây. Liều đáy : 18,78 rad/giây.
Liều dịch chuyển
Liều đỉnh : 246,27 rad/giây Liều trung tâm : 396,27 rad/giây Liều đáy : 346,27 rad/giây
Dung tích buồng chiếu là 4 lít. Chiều cao 24 cm, đƣờng kính 15 cm.
Các ứng dụng và tính toán đƣợc dựa trên cơ sở suất liều phát xạ trung tâm và liều dịch chuyển trung tâm, công thức tính thời gian xử lý mẫu nhƣ sau:
T = Liều cần chiếu (rad) – Liều dịch chuyển (rad) / Suất liều phát xạ (rad/ giây) T: thời gian mẫu cần đƣợc xử lý (giây)
Trong đó:1 Gy = 100 rads. Vậy khi chiếu liều xạ: 200 Gy thì mất 17 phút 150 Gy thì mất 12,67 phút 100 Gy thì mất 8,33 phút 20 Gy thì mất 1,39 phút 40 Gy thì mất 3,12 phút 60 Gy thì mất 4,86 phút
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Pha môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) bổ sung nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng BA, IBA, TDZ, 2,4-D khác nhau tùy theo từng nghiệm thức.
Môi trƣờng đƣợc cho vào bình nuôi cấy có dung tích là 250 ml, mỗi bình chứa 30 ml môi trƣờng hấp ở 121oC; 1,2 atm trong 25 phút.
3.4.2. Nội dung nghiên cứu
3.4.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsici đến sinh
trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu
Phƣơng pháp thí nghiệm
Phƣơng pháp tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro
Tạo mô sẹo từ lá cây tiêu trên môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xảy ra trong bóng tối và mô sẹo đƣợc tạo thành từ những vết thƣơng trong quá trình cắt mẫu lá.
Sử dụng cây tiêu nuôi cấy in vitro, lấy mẫu lá cắt nhỏ thành những mẫu nhỏ (0,4 cm x 0,4 cm). Đặt vào môi trƣờng sao cho mặt dƣới lá tiếp xúc với môi trƣờng. Mỗi chai cấy 4 - 5 mẫu lá nhỏ. Sau đó, để vào trong bóng tối trong 2 tuần, khi từ những vết cắt bắt đầu xuất hiện sự sùi mô sẹo thì lấy ra để ngoài ánh sáng nhẹ (50 µmol/m2/s) để mô sẹo tiếp tục phát triển.
Lấy mô sẹo để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Quá trình tạo mô sẹo đƣợc tiến hành trong điều kiện: Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar và 8,5 g/l đƣờng saccharose, 1 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml. Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn trong 2 tuần đầu, 3 tuần sau đó cƣờng độ ánh sáng là 50 µmol/m2
/s. Nhiệt độ: 25 ± 20C và ẩm độ: 65 ± 5%.Thời gian theo dõi thí nghiệm: 5 tuần
Phƣơng pháp nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora capsici
Giống nấm Phytophthora capsici sử dụng trong thí nghiệm là giống nấm đã đƣợc phân lập tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Nấm Phytophthora capsici đƣợc cấy và nuôi trong môi trƣờng CRA (môi trƣờng dinh dƣỡng cho nấm phát triển gồm: Cà rốt, CaCO3 và agar) 48 giờ. Sau đó đƣợc nuôi trong dung dịch nuôi cấy cà rốt 20%, để trong bóng tối từ 48-72 giờ. Rửa sạch và tiếp tục nuôi ngoài sáng trong nƣớc cất trong 2 - 3 ngày.
Lọc nấm bằng vải lọc rồi lọc bằng giấy lọc và sau cùng là lọc bằng đầu lọc vô trùng với màng lọc có kích thƣớc 0,45 µm để lấy dịch nuôi cấy nấm tiến hành thí nghiệm.
Nấm Phytophthora capsici đƣợc nuôi trong điều kiện: Nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng CRA: môi trƣờng gồm cà rốt, CaCO3 và agar khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. Thể tích môi trƣờng trên đĩa petri 10 ml. Nhiệt độ phòng và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 10 ngày.
Chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy tạo mô sẹo
Pha môi trƣờng MS lỏng có bổ sung 1 mg/l 2,4D và 3 mg/l BA hấp khử trùng. Lấy dịch nấm đã đƣợc vô trùng bằng đầu lọc vô trùng cho vào môi trƣờng thí nghiệm. Sau đó, cho môi trƣờng lỏng vào chai nuôi cấy 250 ml có sẵn một lớp bông gòn ở trong sao cho môi trƣờng vừa ngập qua miếng bông là đƣợc.
Mô sẹo nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung dịch chiết thực hiện trong điều kiện: Cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s, mô sẹo đƣợc cấy trên môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l và BA 3 mg/l với nồng độ dịch nấm là 0, 20, 30 và 40%. Nhiệt độ: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%. Đặt trên máy lắc trong suốt quá trình thí nghiệm. Thời gian theo dõi thí nghiệm 3 tuần.
Giải phẫu, nhuộm mẫu mô sẹo tiêu và xem kết quả dƣới kính hiển vi
Sau 1, 2 và 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng lắc có dịch nấm, tiến hành cắt lát mỏng mô sẹo, nhuộm mẫu và xem kết quả dƣới kính hiển vi với nhiều vật kính khác nhau.
Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm: Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng nhạt hay tím nhạt nếu màng tế bào bằng chất cellulose pectic.
Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất gỗ (ligin) hay bần (suberin).
Quy trình nhuộm:
Cắt lát mỏng mô sẹo. Ngâm trong nƣớc Javel trong 15 phút để loại nội dung tế bào. Rửa nƣớc cho sạch Javel. Ngâm mẫu trong acid acetic trong 5 phút để loại Javel còn lại. Rửa nƣớc cho sạch acid acetic. Nhuộm bằng phẩm nhuộm hai màu trong 3 phút. Rửa nƣớc cho sạch phẩm thừa.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên , 3 lần lặp lại. Thí nghiệm thực hiện với môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BA và các nồng độ dịch nấm khác nhau. Tổng số bình: 36. Tổng số mẫu cấy: 144.
Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora capsici trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu
STT Tên nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 P0 0 3 4 2 P1 20 3 4 3 P2 30 3 4 4 P3 40 3 4
Chỉ tiêu theo dõi
Tỉ lệ mẫu sống ở mỗi nghiệm thức Tỉ lệ mẫu tạo sẹo
Trạng thái mô sẹo
Xem và so sánh sự khác biệt (hình dạng, kích thƣớc) giữa các mô giải phẫu của các mẫu ở mỗi nghiệm thức khác nhau. Các chỉ tiêu trên đƣợc ghi nhận 7 ngày một lần.
3.4.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu
Phƣơng pháp thí nghiệm
Sử dụng mô sẹo đã tạo ra ở thí nghiệm 1 để tiến hành thí nghiệm. Pha môi trƣờng nghiệm thức là môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng với nồng độ khác nhau. Các chất kích thích đƣợc dùng trong thí nghiệm này gồm: BA, IBA và TDZ. Lấy mô sẹo cấy vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng. Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng. pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml. Cƣờng độ ánh sáng: 50 µmol/m2
/s. Nhiệt độ: 25 ± 20C và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 4 tuần.
Sau 2, 3 và 4 tuần nuôi cấy thì giải phẫu, nhuộm mẫu mô sẹo tiêu và xem trên kính hiển vi nhƣ ở thí nghiệm 1.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Số bình của mỗi nghiệm thức: 3. Số mẫu trong 1 bình: 4. Tổng số bình: 63. Tổng số mẫu cấy: 252
Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm của các môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng trong
nuôi cấy mô sẹo tiêu
Nghiệm thức Môi trƣờng cơ bản Chất kích thích sinh trƣởng (mg/l) BA IBA TDZ K0 MS 3 0 0 K1 MS 10 1 0 K2 MS 20 1 0 K3 MS 1 10 0 K4 MS 1 20 0 K5 MS 0 1 1 K6 MS 0 1 2
3.4.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu
Phƣơng pháp thí nghiệm
Mô sẹo và chồi của tiêu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Mô sẹo đƣợc đặt trong môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Còn chồi đƣợc đặt trong môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA.
Sau 3 tuần nuôi cấy, tiến hành chiếu xạ với liều xạ 20, 40 và 60 Gy tại Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lat. Sau 2, 3 và 4 tuần chiếu xạ thì tiến hành giải phẫu, nhuộm và xem mẫu trên kính hiển vi.
Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar, 30 g/l đƣờng saccharose, 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D với sự thay đổi về liều xạ gamma, môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút. Tƣơng tự, chồi tiêu cũng đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar, 30 g/l đƣờng saccharose và BA 3 mg/l. pH môi trƣờng: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml /bình 250 ml. Cƣờng độ ánh sáng: 50 µmol/m2/s. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày. Nhiệt độ nuôi: 25 ± 20
C và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian thí nghiệm là 60 ngày.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm này đƣợc chia làm hai thí nghiệm gồm:
Thí nghiệm chiếu xạ gamma trên mô sẹo tiêu
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số bình: 64. Tổng số mẫu cấy: 256.
Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát
triển và khả năng tạo đột biến mô sẹo tiêu
STT Tên nghiệm thức Liều xạ gamma (Gy) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 S0 0 4 4 2 S1 20 4 4 3 S2 40 4 4 4 S3 60 4 4
Thí nghiệm chiếu xạ gamma trên chồi tiêu
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số bình: 64
Tổng số mẫu cấy: 256
Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát
triển và khả năng tạo đột biến chồi tiêu
STT Tên nghiệm thức Liều xạ gamma (Gy) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 C0 0 4 4 2 C1 20 4 4 3 C2 40 4 4 4 C3 60 4 4
Chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2 và 3
Tỉ lệ mẫu sống ở mỗi nghiệm thức Tỉ lệ mẫu xuất hiện chồi
Trạng thái mô sẹo
Xem và so sánh sự khác biệt (hình dạng, kích thƣớc) giữa các mô giải phẫu của các mẫu ở mỗi nghiệm thức khác nhau.
Các chỉ tiêu trên đƣợc ghi nhận 7 ngày một lần
3.5. Phân tích thống kê
Xử lý số liệu thống kê bằng cách phân tích ANOVA sử dụng phần mềm Statgraphics 7.0
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu
4.1.1. Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro
Sau 2 tuần nuôi cấy trong bóng tối tại những vết cắt (ở mép lá) bắt đầu xuất hiện những vết sần là dấu hiệu mô sẹo bắt đầu hình thành. Sau 3 tuần tiếp tục phát triển ở điều kiện chiếu sáng (cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s), mô sẹo đã phát triển ở toàn bộ mẫu lá.
4.1.2. Nuôi cấy mô sẹo tiêu trong môi trƣờng có bổ sung dịch chiết nấm
Phytophthora capsici
Sử dụng mô sẹo cấy vào môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch nấm với các nồng độ là 0, 20, 30 và 40%.
B A
Hình 4.1 Mô sẹo hình thành từ lá cây tiêu in vitro trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D. A: Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong
điều kiện tối; B: Mô sẹo tiếp tục đƣợc nuôi cấy ở cƣờng độ ánh sáng nhẹ 50 µmol/m2/s
Tỉ lệ sống
Sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng dịch nấm lỏng lắc, chúng tôi nhận thấy mô sẹo trong nghiệm thức P0 (đối chứng), P1, P2 và P3 vẫn phát triển bình thƣờng và bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng mẫu bị đen ở phần tiếp xúc với môi trƣờng. Tuy nhiên, ở nghiệm thức P0 mô sẹo phát triển hơn hẳn các nghiệm thức còn lại.
Sau 2 tuần nuôi cấy: các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê. Chúng tôi nhận thấy hầu hết các mô sẹo trong môi trƣờng có dịch nấm đều bị đen và môi trƣờng nuôi cấy cũng có màu đen nhạt. Các mẫu bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng chết đen đặc biệt là những phần mô sẹo thì bị đen nhiều. Ở nghiệm
Hình 4.2 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 1 tuần nuôi cấy. P0: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l
2,4-D. P1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 20%. P2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 30%. P3: Mô sẹo trên môi